转录组无参比对教程

写在前面

2023年将结束，小杜的生信笔记分享个人学习笔记也有2年的时间。在这2年的时间中，分享算是成为工作、学习和生活中的一部分。自己为了运行和维护社群也算花费大量的时间和精力，自己认为还算满意吧。对于个人来说，自己一直的目的都是分享自己的学习笔记，以及多多少少可以帮助解决一下需要帮助的同学。我们这里所说的是需要帮助的人，而不是大部分人。自己的能力和精力自己清楚，自己研究的方向也是比较局限，我们并不知专职做这块的博主，等等…。因此，我这边一直在鼓励大家投稿，但事与愿违的事情很多…。

害！最后，还是那句话：一边学习，一边总结，一边分享！

转录组无参比对教程

当作物是没有参考基因组时，需要无参进行比对。Trinity是现在使用最广泛的转录组De novo组装软件。

Trinity 是无参考转录组从头组装转录组的常用软件，且trinity的使用文档非常详细，整合的内容非常完整，包括从组装，比对，定量到差异分析等。因此有大神也推荐Trinity可作为初学者了解熟悉转录组分析流程的入门和进阶学习文档。

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原文链接：转录组无参比对教程

1.1 软件安装

**官方文档：**https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki

Trinity通过有秩序的对大规模的RNA-seq Reads数据进行读取，高效的完成转录组的组装，包含三个独立的软件模块：

Inchworm 将RNA-seq原始数据组装成unique序列
Chrysalis 将Inchworm 生成contigs聚类，每个类构建Bruijn图
Butterfly 处理Bruijn图，依据图中reads

conda安装

## 搜索conda的版本
$ conda search trinity 
#---
trinity                        2.9.1      h8b12597_1  anaconda/cloud/bioconda
trinity                       2.11.0      h5ef6573_0  anaconda/cloud/bioconda
trinity                       2.11.0      h5ef6573_1  anaconda/cloud/bioconda
trinity                       2.12.0      h5ef6573_0  anaconda/cloud/bioconda
trinity                       2.12.0      ha140323_1  anaconda/cloud/bioconda
trinity                       2.12.0      ha140323_2  anaconda/cloud/bioconda
trinity                       2.12.0      ha140323_3  anaconda/cloud/bioconda
trinity                       2.13.2      h00214ad_1  anaconda/cloud/bioconda
trinity                       2.13.2      h15cb65e_2  anaconda/cloud/bioconda
trinity                       2.13.2      ha140323_0  anaconda/cloud/bioconda
trinity                       2.13.2      hea94271_3  anaconda/cloud/bioconda
#-----------
conda install -y trinity

源码安装

The Trinity software package can be downloaded here on GitHub. Legacy versions (pre-2015) are still available at our Sourceforge Trinity software archive.

Runtime and transcript reconstruction performance stats are available for current and previous releases.

wget https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/archive/refs/tags/Trinity-v2.15.0.zip
unzip Trinity-v2.15.0.zip
## 
echo 'PATH=$PATH:~/software/trinityrnaseq-Trinity-v2.15.0'

1.2 Trinity使用

Trinity组装原理

Trinity组装依据的算法是de Bruijn Graph,即从打断的文库中提取一定长度的K-mer，然后根据k-1错位相似的方法拼接组装的可能路径，最终确定完整的参考组装转录组。

Trinity根据该原理，将主要操作步骤分为3个模块，分别形象的命名为虫，蛹，蝶：

序列延伸 (inchworm) ——虫
- 将 reads切为 k-mers (k bp长度的短片段)
- 利用Overlap关系对k-mers进行延伸 (贪婪算法)
- 输出所有的序列 (“contigs”)
构建 de Bruijn graph (chrysalis)——蛹
- 聚类所有相似区域大于k-1bp的 contigs
- 构图 (区分不同的 “components”)
- 将reads比对回 components，进行验证
解图，列举转录本 (butterfly)——蝶
- 拆分graph 为线性序列
- 使用reads以及 pairs关系消除错误序列
  
  Trinity组装

Trinity --seqType fq --max_memory 100G --left reads_1.fq.gz --right reads_2.fq.gz --SS_lib_type RF --CPU 30 --output ../outputPATH --min_contig_length 200 --jaccard_clip --trimmomatic --normalize_reads --bflyCalculateCPU

必须参数：

--seqType <string>      :type of reads: ('fa' or 'fq')reads的类型
--max_memory <string>      :suggested max memory to use by Trinity where limiting can be enabled. (jellyfish, sorting, etc)provided in Gb of RAM, ie.  '--max_memory 10G'最大内存的大小，GB
--left  <string>    :left reads, one or more file names (separated by commas, no spaces)双段转录组数据编号为1的数据，如果对多组数据进行分析，则使用都好`,`将文件进行分开
--right <string>    :right reads, one or more file names (separated by commas, no spaces)双段转录组数据编号为2的数据，如果对多组数据进行分析，则使用都好`,`将文件进行分开## 或是使用下面的表达方式
or, if unpaired reads:--single <string>   :single reads, one or more file names, comma-delimited (note, if single file contains pairs, can use flag: --run_as_paired )Or,--samples_file <string>         tab-delimited text file indicating biological replicate relationships.ex.cond_A    cond_A_rep1    A_rep1_left.fq    A_rep1_right.fqcond_A    cond_A_rep2    A_rep2_left.fq    A_rep2_right.fqcond_B    cond_B_rep1    B_rep1_left.fq    B_rep1_right.fq                                        cond_B    cond_B_rep2    B_rep2_left.fq    B_rep2_right.fq# if single-end instead of paired-end, then leave the 4th column above empty.

可选参数：

--SS_lib_typereads的方向，成对的reads：RF or FR; 不成对的reads：F or R。在数据具有特异性的时候，设置参数，则正义与反义转录子能得到区分。默认情况下，不设置此参数，reads被当做非特异性处理。RF：reads.1.fq文件的序列和基因序列反向互补，reads.2.fq文件的序列和基因序列一致，次情况下特异性测序的类型。FR：与RF相反，reads。1.fq文件的序列和基因序列一致，reads。2.fq文件的序列和基因序列互补。.......