windows ubuntu子系统，单细胞篇 1.cellranger安装与分析

这几天，我将单细胞测序在windows ubuntu子系统中跑了一遍，将过程分享給大家。

单细胞测序
conda create -n 10xdb #创建环境

conda activate 10xdb
conda install -c bioconda cellranger -y #失败，可能源中没有

wget -O cellranger-7.2.0.tar.gz "https://cf.10xgenomics.com/releases/cell-exp/cellranger-7.2.0.tar.gz?Expires=1702235980&Key-Pair-Id=APKAI7S6A5RYOXBWRPDA&Signature=c5ZVKLpCggvKE5O1o0pR7X-IfMXAkWZdQ9o-BipsD9PQJP31eIR2vpy2J2Ucd5faQyM0ZgjsO98qdF616z62D4SRvJDHeYkdQzGSmoZNzcWRLM1Getvend4HkSxPxjePb5MhvohRKsh9~wR2RVivMSZXpiy6zhH1efwcF4-PPmSwJshbhU3pI7InTt5qg92kasL3ekv~8D-scp3kAiFwm15d-ufvblrox8g4P9JQjFHHDjLuu0F~P8-Qc31lMdOe~5KoDCbkE~UI7sEUBJktD0MR~lZ620OcYKgvaqCB-wLgI3VI0rH8RPxYvbgUXryBHnB0wEmqjaessFlNvhql1Q__"#下载成功

tar -xzvf cellranger-7.2.0.tar.gz #tar 解压缩
vim ~/.bashrc
export PATH="/mnt/h/softwore/cellranger-7.2.0/bin/:$PATH" ,source ~/.bashrc,#成功

#下载人源比对基因组
wget "https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-GRCh38-2020-A.tar.gz" #这里下载太慢
在windows环境中下载
md5sum refdata-gex-GRCh38-2020-A.tar.gz
tar -xzvf refdata-gex-GRCh38-2020-A.tar.gz

mkdir 1.sra 2.raw_fastq 3.cellranger，cd 1.sra，touch download_file, #创建目录，创建文件。

vim download_file #编辑文件，文件名。
SRR7722941
SRR7722942

cat download_file |while read id;do (prefetch $id &);done #NCBI下载单细胞数据。下载方法和软件可见,最好早上下载。

3.windows下Ubuntu，sratoolkit软件，从ncbi的sra数据库下载数据。_sratools下载数据-CSDN博客

下载完数据后，将SRR数据转为fastq格式。

ls SRR* | while read id;do ( nohup fasterq-dump -O ./ --split-files -e 6 ./$id --include-technical & );done

#使用"ls SRR*"查找以"SRR"开头的文件，然后使用"while read id"逐行读取这些文件名，对每个文件执行以下操作：使用fasterq-dump命令下载SRA文件，将其转换成FASTQ格式，并将结果保存在当前目录下。使用--split-files选项将每个样本的双端序列拆分成两个文件。使用-e 6选项指定最大重试次数为6。使用--include-technical选项包括技术序列。使用&符号将每个命令放入后台执行，以便同时处理多个文件，加快处理速度。

#对10X的fq文件运行CellRangerd的counts流程，我们只做一个文件，首先，我们先改名。

mv SRR7722937_1.fastq.gz SRR7722937_S1_L001_I1_001.fastq.gz，

mv SRR7722937_2.fastq.gz SRR7722937_S1_L001_R1_001.fastq.gz，

mv SRR7722937_3.fastq.gz SRR7722937_S1_L001_R2_001.fastq.gZ

#每个SRR分出三个fastq文件，查阅资料是

SRR7722941_S1_L001_I1_001.fastq：这是Index序列文件，包含了每个序列的索引信息。
SRR7722941_S1_L001_R1_001.fastq：这是Read 1序列文件，包含了每个序列的第一部分。
SRR7722941_S1_L001_R2_001.fastq：这是Read 2序列文件，包含了每个序列的第二部分。

#接下来运行Cellranger count流程

ref=/mnt/h/db/cellranger.db/refdata-gex-GRCh38-2020-A
id=SRR7722941

cellranger count --id=$id \
--transcriptome=$ref \
--fastqs=/mnt/h/sxfx/2023.1210.db/2.raw_fastq \
--sample=$id \
--nosecondary \
--localmem=15 \
--localcores=15

cellranger count：这是Cell Ranger软件的一个子命令，用于对单细胞RNA测序数据进行计数。
--id=$id：指定输出结果的唯一标识符，通常是分析的样本名称或编号，指定输出文件夹的名字。
--transcriptome=$ref：指定参考转录组的路径或者名称。这个参数告诉Cell Ranger在分析中使用哪个转录组参考序列。
--fastqs=/mnt/h/sxfx/2023.1210.db/2.raw_fastq：指定原始FASTQ文件的路径。这个参数告诉Cell Ranger去哪里查找原始的测序数据。
--sample=$id：指定样本名称或编号。这个参数用于告诉Cell Ranger如何标识分析中的每个样本。
--nosecondary：这个参数告诉Cell Ranger在对数据进行比对和计数时不考虑次要的比对结果。次要比对结果是指在一个位置有多个可能的比对结果时，除了最佳的比对结果外的其他比对结果。
--localmem=15：指定本地内存的使用量，单位为GB。这个参数告诉Cell Ranger在运行过程中最多可以使用多少内存。
--localcores=15：指定本地CPU核心数。这个参数告诉Cell Ranger在运行过程中最多可以使用多少CPU核心。

#最终结果在outs中

结果解读（参考生信技能树Jimmy的帖子）：

web_summary.html：必看，官方说明 summary HTML file ，包括许多QC指标，预估细胞数，比对率等；
metrics_summary.csv：CSV格式数据摘要，可以不看；
possorted_genome_bam.bam：比对文件，用于可视化比对的reads和重新创建FASTQ文件，可以不看；
possorted_genome_bam.bam.bai：索引文件；
filtered_gene_bc_matrices：是重要的一个目录，下面又包含了 barcodes.tsv.gz、features.tsv.gz、matrix.mtx.gz，是下游Seurat、Scater、Monocle等分析的输入文件，是经过Cell Ranger过滤后构建矩阵所需要的所有文件；
filtered_feature_bc_matrix.h5：过滤掉的barcode信息HDF5 format，可以不看；
raw_feature_bc_matrix：原始barcode信息，未过滤的可以用于构建矩阵的文件，可以不看；
raw_feature_bc_matrix.h5：原始barcode信息HDF5 format，可以不看；
analysis：数据分析目录，下面又包含聚类clustering（有graph-based & k-means）、差异分析diffexp、主成分线性降维分析pca、非线性降维tsne，因为我们自己会走Seurat流程，所以不用看；
molecule_info.h5：可用于整合多样本，使用cellranger aggr函数；
cloupe.cloupe：官方可视化工具Loupe Cell Browser 输入文件，无代码分析的情况下使用，会代码的同学通常用不到。