文章分享：《呼吸道传染病标本采集及检测专家共识》

【摘要】呼吸道传染病临床特点多表现为发热和（或）呼吸道症状，病原学组成复杂，标本类型选择多样，如何从发热伴呼吸道症候群患者中早期正确识别出潜在呼吸道传染病患者是防控的关键环节。增强医务人员对呼吸道传染病临床特点的认知，规范临床标本采集，选择病原学检测技术及恰当的解读报告，是十分重要的。因此，组织专家对上述问题进行讨论并撰写专家共识，以期提高各级、各类医疗机构对呼吸道传染病的早期识别和诊断能力。

呼吸道传染病是全球重大公共卫生问题。近些年，新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）（简称新冠）和流行性感冒（简称流感）严重影响着人民群众健康和社会经济发展。在我国，发热门诊是呼吸道传染病防控与救治的第一道防线。早期从发热伴呼吸道症候群（定义见附件1）患者中正确识别出潜在呼吸道传染病患者是防控的关键环节。这要求医务人员对呼吸道传染病的临床特点、规范的标本采集和病原学检测技术有深刻的理解和熟练的掌握。鉴于此，组织专家编写本共识，以期助力提高各级各类医疗机构对呼吸道传染病的早期识别和诊断能力。

（一）COVID-19

推荐意见1：核酸检测是确诊COVID-19的金标准。对发热和（或）呼吸道症状及腹泻、嗅（味）觉减退等COVID-19相关症状，在具备核酸检测能力的医疗机构，推荐首选送检鼻咽拭子或口咽拭子，进行新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 SARS-CoV-2）核酸检测。

推荐意见2：在不具备核酸检测能力的医疗机构，对出现发热和（或）呼吸道症状及腹泻、嗅（味）觉减退等COVID-19相关症状5 d内的患者可选择抗原检测进行初步筛查。抗原检测阴性人员，应自就诊当日起连续5 d、1次/d抗原检测，如抗原结果一直阴性、直至症状消失的，可不采取其他干预措施。抗原结果一旦阳性，由社区（村镇）联系急救中心按照新冠肺炎疫情相关人员转运工作指南，将其转运至设有发热门诊的医疗机构，进行核酸检测，阳性人员使用后的采样拭子、采样管、检测卡等装入密封袋一并转运至医疗机构作为医疗废物处置。

（二）流感和禽流感

推荐意见3：在流感流行季，对重症或有重症流感高危因素的“流感样病例”，应留取鼻咽拭子或口咽拭子进行病原学检测，明确诊断。但要注意，应尽早给予抗流感病毒治疗药物，不必等病原学结果。

推荐意见4：在流感流行季，对非重症且无重症流感高危因素的“流感样病例”，应当充分评估进一步传播风险和收益，考虑是否进行病原学送检。其中，与重症流感高危因素人群共同生活和（或）居住的“流感样病例”，建议留取鼻咽拭子或口咽拭子进行病原学检测。

推荐意见5：在具备核酸检测能力的医疗机构，建议送检鼻咽拭子或口咽拭子进行流感病毒核酸检测。在不具备核酸检测能力的医疗机构，可选择流感抗原检测。在流感流行季，抗原检测结果阳性，支持诊断，但阴性结果不能排除流感病毒感染。在流感低发时期，需警惕流感抗原检测结果假阳性的可能。

推荐意见6：对拟诊禽流感的患者，应采集呼吸道标本进行核酸检测。对于以上呼吸道症状为主的患者，可选择鼻咽拭子或口咽拭子；出现下呼吸道症状时，应选择深部痰、BALF等标本送检。

推荐意见7：对拟诊流感的患者，常见季节性流感病毒和禽流感病毒检测阴性，需警惕新型流感病毒出现可能，建议按照所在地区的政策要求上报，并规范留取标本送检。具备高通量测序技术且实验室符合生物安全的医疗机构也可同时进行mNGS检测。

（三）肺结核

推荐意见8：在出现肺结核相关临床表现时，可选择痰液、诱导痰、BALF或肺组织标本检。痰涂片抗酸杆菌镜检为最简单、快速的方法；结核分枝杆菌培养是诊断的金标准。核酸检测可作为结核病的一线检测手段，并作为利福平耐药的初始检测方法。对于上述病原学检测阴性而临床仍高度怀疑肺结核的患者，建议行γ-干扰素释放试验以辅助诊断，其结果不受卡介苗接种的影响。

（三）肺结核

推荐意见8：在出现肺结核相关临床表现时，可选择痰液、诱导痰、BALF或肺组织标本送检。痰涂片抗酸杆菌镜检为最简单、快速的方法；结核分枝杆菌培养是诊断的金标准。核酸检测可作为结核病的一线检测手段，并作为利福平耐药的初始检测方法。对于上述病原学检测阴性而临床仍高度怀疑肺结核的患者，建议行γ-干扰素释放试验以辅助诊断，其结果不受卡介苗接种的影响。

（四）肺鼠疫

推荐意见9：对于疑似肺鼠疫患者建议送检痰液、胸水和血液等标本（腺鼠疫者还可留取淋巴结穿刺液），进行培养和F1抗原或抗体检测。具备核酸检测能力的医疗机构，可选择行鼠疫耶尔森菌核酸检测。

推荐意见10：鼠疫耶尔森菌为二类高致病性病原微生物。对鼠疫耶尔森菌进行大量活菌操作（如菌冻干种、离心等）以及对动物的感染实验应当在生物安全三级实验室内进行；对样本的检测，如对病原菌的分离纯化、生化鉴定、核酸提取、涂片等可以在生物安全二级实验室内进行。

（五）肺炭疽

推荐意见11：对疑似肺炭疽的患者，建议送检皮肤溃疡的渗出物、痰液、胸腔积液、血液、脑脊液、粪便等标本，进行涂片和培养。若发现大量两端平齐呈串联状排列的革兰阳性大杆菌，可做出临床诊断。具备核酸检测能力的医疗机构，建议送检上述标本进行炭疽杆菌核酸检测。

（六）输入性呼吸道传染病

推荐意见12：对近期有国外旅行史的患者，出现发热和（或）呼吸道症状（咳嗽、呼吸困难）时，根据旅居地呼吸道传染病流行情况，需考虑输入性呼吸道传染病可能。对医疗机构不具备检测能力的病原体，根据所在地政策，建议必要时同时采集上、下呼吸道及血液标本，送检至符合要求的检测机构进行检测。

（七）不明原因肺炎

推荐意见13：对于符合不明原因肺炎病例定义的患者，立即收治入院，按照呼吸道传染病隔离治疗，及时上报，根据要求和规范采集呼吸道标本。

推荐意见14：对于常见已知疾病病原学检测阴性，怀疑有传染性，但不符合不明原因肺炎定义的患者，建议及时上报医院，可选择送检呼吸道标本进行mNGS，首选下呼吸道标本。

四、高通量测序

高通量测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）在呼吸道传染病诊断中，尤其是新发传染病的诊断，mNGS发挥至关重要的作用，如人感染H7N9禽流感病毒、SARS-CoV-2的发现等。但在实际临床工作中，mNGS也存在过度应用的情况，造成医疗资源浪费。因此，临床医生应掌握mNGS的送检时机、结果解读和质量控制等内容。

（一）mNGS送检时机

mNGS的适应证：病情危重需要尽快明确感染病原体；特殊患者如免疫功能抑制宿主、合并基础疾病、反复住院的重症感染者需要尽快明确病原体；传统微生物检测技术反复阴性且治疗效果不佳；疑似新发病原体、临床提示可能有一定传染性；疑似特殊病原体感染；长期发热和（或）伴有其他临床症状、病因不明的感染。符合以上适应证的患者，应尽快送标本进行检测。对于不明原因肺炎病例，必要时可采集BALF样本进行mNGS检测。

mNGS结果解读

1. 标本类型：包括BALF及痰液样本、鼻咽或口咽拭子。采样时尽量以感染病灶相关样本为准；样本采集尽可能避免污染，采样专用器材取样，采样后应及时送检。

2. 测序策略的选择：临床上的呼吸道感染如怀疑是病毒感染则建议同时进行DNA和RNA测序，以覆盖包括RNA病毒在内的全部微生物谱；考虑如结核分枝杆菌、布鲁氏菌等胞内菌，需针对性加强DNA类型宏基因组策略；已经接受广谱抗菌药物治疗的，应考虑数据量加强版的宏基因组策略，降低假阴性。

3. 结果解读：正式报告应包括所检测病原微生物列表、检出病原特异序列数量、检测病原范围、检测方法及检测技术说明。同时对相关专业术语进行解释说明，并注明检测方法的局限性、检测灵敏度和特异性等以及疑似背景微生物。解读报告明确感染病原需要考虑以下原则：①病原体序列的检出在相同或类似症状患者中，应考虑患者免疫特征。②病原体核酸在患病样本中应该占据比较高的丰度或足够的特异。③对呼吸道样本的宏基因组测序，测序数据量要大于40 M reads/样本，使用足够全的参考数据库，以防止假阴性。④检出的病原体序列有其他方法可以进一步验证。⑤应该考虑较高丰度的群体物种关联存在对疾病的影响。 ⑥多次样本检测分析结果应当一致。

（1）阳性结果的解读：因不同部位临床样本的背景微生物存在差异，故阳性的判读需要建立阈值才能界定出真正的病原体。这些阈值包括：检出特定微生物序列的数量、归一化为每百万序列的相对值、检出微生物的基因组覆盖度及内参对照的检出是否符合质控标准等。针对不同病原体应设置对应的阈值：①病毒：一些显著区别于人基因组序列的病毒，如腺病毒和流感病毒等，有少量的特异序列检出即可信，其阈值通常在3/100万及以上即为可信；而一些与人源序列相似度高的病毒，如反转录病毒类，其阈值通常需要超过1 000/100万，如果检出相对较少序列的某类反转录病毒，不排除可能是人基因组中的一些转录元件，可能表明某种反转录病毒在人体内是潜伏状态，而不是感染状态。②真菌：由于真菌存在较厚的细胞壁，即使进行了一些破壁处理，也可能因为破壁不充分而导致核酸提取效率降低，从而导致其检出的特异序列数可能不会很多，因此对于真菌的鉴定，其阈值考虑在5/100万以上，在达到100/100万以前，其可信度随序列数增加而增加。③细菌：对于一些细菌来说，要着重区分是定植菌、污染还是真正的病原菌。对于非胞内感染菌，因不同细菌间存在同源相似性，菌种间可信阈值差异较大，并且不同实验室间存在差异，因此鉴定报告应给出具体菌种的阳性参考阈值，并列出背景菌作为参考；而对于胞内感染菌，如结核分枝杆菌和军团菌的阈值相对较低，通常有1/100万即可考虑可信，随着序列数增加，其可信度逐渐增加，但达到30/100万时，其增量不再有增加可信度的意义。④寄生虫：因为目前寄生虫基因组参考数据库种类不多，且因寄生虫的生物多样性，其作为真核生物有很多与人基因组相似的元件，因此在判断阳性时要特别要求序列的特异性。寄生虫作为阳性判断的阈值需在10/100万以上，并且需要严格确认序列的特异性。

（2）阴性结果的解读：如为阴性报告，则需综合考虑患者的具体情况，是阈值判断错误还是无病原体感染现象，尤其在多次检测均为阴性报告的情况下，其可以考虑为真正的阴性，即患者可能并非感染性疾病，可能是免疫性疾病或肿瘤等。在宏基因组检测报告中，如存在非常多的背景菌或杂菌，但没有1种或者几种占主导优势，可间接考虑患者免疫状态被严重破坏。

（三）mNGS流程质控

在临床实验室中实施mNGS是一项复杂的系统工作，包含样本处理、文库构建、上机测序以及生物信息学分析。因此，流程质控尤为重要，要将mNGS试剂、操作规程纳入标准化才能保证检测质量。可从以下几个方面保证临床实验室准确实施mNGS与临床检测：

1. 独立的实验室以及获得医疗器械注册许可的高通量测序平台：由于样品通常是分批处理的，每个批次都需要监控物种检出的频率，建立正常物种的频率基线，用于判断和排除可能的污染，因此，实验室空气洁净度、仪器、试剂批次等需要建立标准对照和监测系统，实验室存在的背景微生物需定期汇总更新，操作人员需明确记录和严格遵守实验室守则，建立自动化检测平台，将分析工作流程分为多个离散步骤以通过轮换执行，这有助于减少或避免实验误差和错误的出现。

2.样本和内参质控：感染性临床样本种类繁多，不同样本需进行不同的处理方式，每种方式需建立标准的处理流程。每次检测都要设内参，内参检出是检测合格的标准之一。在同一批次的不同样本同时检测时，样本间的短序列交叉污染应该控制在万分之一以下。

3. 数据量保证：建立不同标本基本的序列数据量，由于临床样本中微生物的核酸含量远低于宿主核酸含量，为避免大量宿主细胞的核酸本身带来的测序数据干扰，每次检测均需足够的测序数据量。因不同类型样本中人体本身细胞含量不同，对最低测序数据量要求也应不同。在临床样本中人体细胞占比从少到多的主要代表是：脑脊液＜ BALF ＜血液＜痰液＜胸腹水，推荐的高通量测序序列条数越多越好，对于呼吸道传染病，测序数据量要大于40 M reads。

4. 生物信息分析：mNGS同样存在测序错误的情况，因此在最原始的下机数据中需进行低质量序列的去除，包括测序接头污染的序列、质量值低的序列和短重复序列。人源数据库收集需尽可能完整，不仅包含染色体基因组，还要包括线粒体等基因组、转录组以及非编码序列信息。病原数据库收录的信息不是越多越好，要确保每条收录的序列数据准确、完整。过滤后的序列进行微生物鉴定应有严格的质控标准，用于鉴定种或者属的短序列应为特异序列，特异序列作为最后报告的参数阈值。同时应保留所有检出病原的参数、包括比对序列数、相对丰度、基因组覆盖度和深度等。

5. 数据库的完整和准确：目前不同检测机构都提供了其自身的病原数据库，其完整性和准确性也缺乏统一的标准，因此，相关部门应联合主流检测机构，进一步确定对于数据库质量的标准，用于规范和提升该技术的应用。mNGS在临床的应用，已经初步显示出了其广谱快速鉴定病原的优势，但目前多集中在第三方实验室进行检测，存在标本外送时间长、检验和临床脱节，沟通不及时、标本外送过程导致样本质量不合格、存在患者信息安全和生物安全等诸多问题。因此，建议有条件的医疗机构在本单位实验室建立宏基因组检测平台，精准快速地为急危重症感染者提供诊断依据。