俗话说，一个生物学博士，要跑满1000面胶才能毕业。今天特邀实验室博三大师兄，和大家聊一聊WB内参那些小事。

选择好合适并且好跑的内参，WB实验也就成功了一半。

1. 什么是内参？

内参即内部参照，一般是指由管家基因编码表达的蛋白，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物

2. 内参的作用是什么？

（1）校正蛋白样品定量以及上样过程中的误差，保证实验结果的准确性

（2）作为空白对照，检测WB过程中蛋白转膜是否完全以及发光显色体系是否正常

3. 如何选择内参？

（1）根据样本的种属来源选择，如哺乳动物或者植物等

（2）考虑目的蛋白的分子量大小，一般需要与目的蛋白的分子量相差5kd以上

（3）根据蛋白表达位置选择不同的内参，不同的细胞器中选择的内参也不同

（4）内参的选择需要考虑试验处理条件对于内参表达的影响：

• 由于GAPDH是糖酵解过程中的酶，所以关于糖代谢的研究（如糖尿病模型）不能选择GAPDH作为内参；而某些细胞中，缺氧也会影响GAPDH的表达，此时也不可以选择GAPDH作为内参
• 做细胞骨架相关的研究时不能选择β-actin作为内参
• 做细胞毒性实验时，TATA binding protein和Lamin B会发生变化，此时不可以选择其作为内参

最后，是一些个人实验过程中的感悟和想法。

我自己是在做肿瘤方面的课题，除了做糖代谢方面最好不选择GAPDH作为内参外，将肿瘤组织与正常组织相比时，最好也不要选择GAPDH作为内参，因为很多肿瘤组织中的GAPDH相对于正常组织是高表达的，并且有文献报道GAPDH可以作为肿瘤标志物。

一般情况下，做全细胞和细胞质的WB实验时，选择β-actin基本能满足大部分的需要。而考察细胞核样品时，由于Histone H3是染色体的组成型表达组分，表达相当稳定，并且特别好跑，可以算是细胞核内参的首选

另外，针对一些特定的内参，蛋白上样量超过一定的量时，出来的条带可能不会有显著的差别。以前看过一篇文献讲的应该是β-actin，当上样量超过20 μg时，条带灰度不会呈线性的增加。因此，在做WB校正时，调节合适的上样量也是影响实验成功较大的一个因素。

原文发表于 Island Academic Express

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