前言
转录组测序（RNA-seq）是当下最流行的二代测序（NGS）方法之一，使科研工作者实现在转录水平上定量、定性的研究，它的出现已经革命性地改变了人们研究基因表达调控的方式。然而，转录组测序（RNA-seq）其实是广泛的概念，面对众多的RNA-Seq技术，常常难以选择最合适的方法。本文将概述几种主要的 RNA-Seq 技术，并探讨它们的应用和优势。
转录组测序技术（RNA-seq Tech.）
下面的表格比较了几种常见的 RNA-Seq 测序方法，并对每种方法进行了简述。熟悉这些技术将有助于我在设计实验时做出明智的决定。
RNA-Seq分析方法比较
| 类型 | 目标RNA | RNA选择方法 | 起始材料 | 相对成本 |
|---|---|---|---|---|
| mRNA-Seq | mRNA | Poly(A)选择：利用mRNA尾部的poly(A)尾巴进行分离 | 总RNA、细胞、组织 | 🙂 |
| 总RNA-Seq | mRNA + lncRNA | 去除核糖体RNA，留下其他类型的RNA | 总RNA、细胞、组织 | 🙂🙂 |
| 链特异性 RNA-Seq | mRNA和/或lncRNA | Poly(A)选择或rRNA去除 | 总RNA、细胞、组织 | 🙂🙂 |
| 小RNA-Seq | 小非编码 RNA（miRNA、siRNA、piRNA） | 尺寸分级分离（通过大小分离小RNA，并连接接头到5’磷酸用于测序） | 总RNA、细胞、组织 | 🙂🙂 |
| 超低起始量RNA-Seq | mRNA | Poly(A)选择 | 总RNA（<500 ng）或细胞（<10,000） | 🙂🙂🙂 |
| 单细胞RNA-Seq | mRNA | 分离单个细胞后的Poly(A)选择 补充说明：用于研究单个细胞的基因表达差异。 | 细胞/细胞核 | 🙂🙂🙂🙂 |
| Iso-Seq | 全长 mRNA | Poly(A)选择 | 总RNA | 🙂🙂🙂🙂 |
mRNA = 信使RNA，编码蛋白质的RNA
lncRNA = 长链非编码RNA，不编码蛋白质但具有调控功能的RNA
miRNA = 微小RNA，调控基因表达
siRNA = 小干扰RNA，参与RNA干扰
piRNA = Piwi相互作用RNA，与生殖细胞发育相关
rRNA = 核糖体RNA
信使RNA测序 (mRNA-Seq)
在真核生物中，成熟mRNA转录本具有5’端帽子结构和3’端多聚腺苷酸尾，可通过poly(A)选择特异性富集。具体步骤包括：首先提取总RNA，随后利用寡聚(dT)偶联的磁珠/柱进行杂交，或使用寡聚(dT)引物进行逆转录。由于多聚腺苷酸化的RNA分子在大多数物种中仅占总RNA的1-5%，因此poly(A)选择后的样品浓度通常会降低20-100倍。纯化的mRNA随后被转化为cDNA文库，并通过PCR扩增以提高文库浓度。值得注意的是，PCR扩增可能引入偏差，建议使用最少的扩增循环数(通常12-15个循环)。此外，poly(A)选择可能导致3’端偏差，特别是在RNA部分降解的样本中。尽管存在这些局限性，poly(A)选择仍是真核mRNA文库制备中最经济且最广泛使用的方法。
总RNA测序 (Total RNA-Seq)
总RNA-Seq适用于对蛋白质编码RNA和各类非编码RNA进行全面分析。这些非编码RNA包括长链非编码RNA (lncRNA)、环状RNA (circRNA)和其他调控RNA。特别是lncRNA，它们在基因组中具有重要的表观遗传调控功能，但由于很多lncRNA缺乏poly(A)尾，在常规mRNA-Seq中往往被忽略。在总RNA-Seq中，需要先去除占比高达80-90%的核糖体RNA (rRNA)。主要的rRNA去除方法包括：
- Ribo-Zero技术：使用与rRNA互补的生物素化探针；
- RNase H方法：使用DNA寡核苷酸引导RNase H特异性降解rRNA；
- rRNA反义寡核苷酸捕获法：使用互补序列直接捕获并去除rRNA；
链特异性RNA测序 (Strand-Specific RNA-Seq)
转录本的极性信息对于基因功能注释和转录组分析至关重要。由于真核基因组中存在大量重叠基因和反义转录本，识别转录本的来源链可以提供重要的调控信息。然而，在标准RNA-Seq文库制备过程中，转录本的极性信息常常丢失。链特异性RNA-Seq通过特殊的文库制备方法保留了这些关键信息。主要的链特异性文库构建方法包括：
- dUTP第二链标记法：在第二链cDNA合成时加入dUTP，后续选择性降解含U链（如下图）；
- 5’端接头连接法：利用RNA分子5’端的帽子结构定向连接接头；
- 3’端接头连接法：在RNA片段化后进行定向接头连接；
- 链特异性测序可以与mRNA-Seq或总RNA-Seq结合使用，能够：准确鉴定反义转录本；分析重叠基因的表达；研究顺式/反式调控元件；提高转录组拼接的准确性等；
链特异性RNA文库制备。在第二链合成过程中掺入dUTP以及随后的尿嘧啶特异性消化可以选择性地保留第一链cDNA
小RNA测序 (Small RNA-Seq)
小 RNA，如 microRNA (miRNA) 和小干扰 RNA (siRNA)，在基因调控中发挥着重要作用。Small RNA-Seq 通过尺寸分级分离从总 RNA 中选择小 RNA 进行测序。文库制备通常包括将测序接头连接到 Dicer 修饰的小 RNA 5’ 磷酸末端。小 RNA 片段随后被逆转录成 cDNA 并进行测序。由于小 RNA 分子长度较短 (可短至 21 个核苷酸)，可以使用较少的测序循环数 (例如 1×50 bp)。
超低起始量RNA测序 (Ultra-Low Input RNA-Seq)
标准 RNA-Seq 方法通常需要大量的完整 RNA (>500 ng)。对于 RNA 产量低或降解的样品，需要额外的扩增步骤和更高的测序深度以提高数据输出，但这容易导致转录偏差。超低起始量 RNA-Seq 方法能够选择性扩增全长转录本，同时最大限度地减少偏差，使得研究人员能够对少量细胞的样品进行 RNA-Seq。
单细胞RNA测序 (scRNA-Seq)
与传统的“批量”RNA-Seq 不同，scRNA-Seq 能够捕获单个细胞的转录组，揭示复杂细胞群体中基因表达的异质性。scRNA-Seq 通常使用微流体（华大、10X等）或微孔技术(华大、BD、新格元等)分离单个细胞，并在文库制备过程中为每个转录本添加唯一的条形码，以便通过生物信息学分析追溯到其来源细胞。
全长转录本测序 (Iso-Seq)
Iso-Seq 技术，例如 PacBio® 开发的平台，使用长读长测序技术对全长转录本进行测序，无需组装。 这使得能够直接识别转录本起始位点、多聚腺苷酸化位点和剪接位点。Iso-Seq 可用于表征转录组中的所有异构体，其应用包括基因组注释、基因融合检测和新异构体的发现。可变剪接导致单个基因编码多种异构体，这可以通过Iso-Seq有效地进行分析。
选择指南
选择合适的 RNA-Seq 测定方法取决于几个因素，包括：实验目标、感兴趣的 RNA 种类（编码、非编码或两者）
、材料、是否有参考转录组等。准确定义生物学问题至关重要，有一个清晰而具体的目标将帮助确定需要哪种类型的 NGS 数据，进而确定哪种 RNA-Seq 方法最合适。 下面是一个简化的树，可以辅助决策
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 算法详解及案例分析)
