1.bedtools 文档
$ bedtools --version
bedtools v2.31.1coverage Compute the coverage over defined intervals.
Usage:bedtools coverage [OPTIONS] -a <FILE> \-b <FILE1, FILE2, ..., FILEN>(or):coverageBed [OPTIONS] -a <FILE> \-b <FILE1, FILE2, ..., FILEN>注意: As of version 2.24.0, the coverage tool has changed such that the coverage is computed for the A file, not the B file. This changes the command line interface to be consistent with the other tools.
从2.24.0版本开始，计算的是A文件的覆盖度，而不是B文件。
重要参数:
- https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/content/tools/coverage.html
## bedtools coverage -a positions.bed -b aligned_reads.bam -d > position_depth.txt
-a BAM/BED/GFF/VCF file “A”. Each feature in A is compared to B in search of overlaps. Use “stdin” if passing A with a UNIX pipe.
-b One or more BAM/BED/GFF/VCF file(s) “B”. Use “stdin” if passing B with a UNIX pipe. NEW!!!: -b may be followed with multiple databases and/or wildcard (*) character(s).
-d Report the depth at each position in each A feature. Positions reported are one based. Each position and depth follow the complete A feature.
2.测试
(1) 准备bed文件
$ cd /home/wangjl/tmp找到一个IGV的峰图范围
$ cat positions.bed
chr1 246766959 246768109
(2)运行
$ bedtools coverage -a positions.bed -b /datapool/wangjl/scPolyA-seq2/chenxi/PBMC/cluster_bam/RNA/RNA_cluster0.pA_reads.sorted.bam -d > position_depth.txt
# 20:09->20:11
警告:***** WARNING: File /datapool/wangjl/scPolyA-seq2/chenxi/PBMC/cluster_bam/RNA/RNA_cluster0.pA_reads.sorted.bam has inconsistent naming convention for record:GL000008.2 47002 47037 A01758:191:HGG7FDSX5:3:1561:3830:23844_AGTAAACC_TCCACCGTAT 255 -***** WARNING: File /datapool/wangjl/scPolyA-seq2/chenxi/PBMC/cluster_bam/RNA/RNA_cluster0.pA_reads.sorted.bam has inconsistent naming convention for record:GL000008.2 47002 47037 A01758:191:HGG7FDSX5:3:1561:3830:23844_AGTAAACC_TCCACCGTAT 255 -
(3)查看输出文件
可见，前三列和输入的-a bed文件一致，第四列是逐个碱基位置编号，第五列是该位置的测序深度。
246768109-246766959=1150, 可见，这是一个半开半闭区间。比如 1-2 只算1个碱基，到底哪边开呢？一般是 [)。在 (5)中我们做测试。
$ wc position_depth.txt1150 5750 36843 position_depth.txt
$ head position_depth.txt
chr1 246766959 246768109 1 17
chr1 246766959 246768109 2 17
chr1 246766959 246768109 3 17
...
$ tail position_depth.txt
...
chr1 246766959 246768109 1148 19
chr1 246766959 246768109 1149 19
chr1 246766959 246768109 1150 19
(4)R绘图，和IGV峰图比较
按照x=第4列,y=5th画图
$ R
> dat=read.table("position_depth.txt")
> plot(dat$V4, dat$V5, type="o", cex=0.5)
缩小到长宽基本一致，看起来还是挺像IGV峰图的。
图1：上图是IGV图，下图是逐位点的测序深度连线图。
(5)验证 bedtools 对bed是取左闭右开区间
在IGV中找到最高峰附近的1bp
目测: 8 上有reads，9上没有。
$ cat positions2.bed
chr1 246767468 246767469$ bedtools coverage -a positions2.bed -b /datapool/wangjl/scPolyA-seq2/chenxi/PBMC/cluster_bam/RNA/RNA_cluster0.pA_reads.sorted.bam -d > position_depth2.txt$ cat position_depth2.txt
chr1 246767468 246767469 1 15
说明1.单个碱基，2.有reads。支持[)区间。
2)再次测试：chr1 246767468 246767470
输出:
$ cat position_depth2.txt
chr1 246767468 246767470 1 15
chr1 246767468 246767470 2 15
失败，竟然都有reads?!
难道，是取了滑动平均值？取平均就不是按位点取测序深度了。
3)再试，争取测试到有reads和无reads的分界线
发现往后延申坐标不行，都是15。而往前延申坐标可以！
$ cat positions2.bed
chr1 246767458 246767470
输出:
$ cat position_depth2.txt
chr1 246767458 246767470 1 80
chr1 246767458 246767470 2 78
chr1 246767458 246767470 3 60
chr1 246767458 246767470 4 53
chr1 246767458 246767470 5 53
chr1 246767458 246767470 6 53
chr1 246767458 246767470 7 53
chr1 246767458 246767470 8 53
chr1 246767458 246767470 9 46
chr1 246767458 246767470 10 46 #这个位置应该是58+10-1=67
chr1 246767458 246767470 11 15
chr1 246767458 246767470 12 15
推测：15就是本该是0的背景噪音了？
结论:
- i) bedtools取bed区间时，按照左闭右开区间。
- ii) bed记录的坐标是0-based，就是igv(1-based)看到的坐标减去1。
推理: 我想要某个点的 pos=8 的reads 深度，该怎么设置bed？
- i)bedtools 就需要设置 [pos, pos+1)位置；
- ii)写成bed格式要坐标-1，就是 chr pos-1 pos，也就是 chr 7 8
验证1: 取pos=8的深度，igv有
$ cat positions2.bedchr1 246767467 246767468输出:$ cat position_depth2.txtchr1 246767467 246767468 1 46
验证2: 取pos=9的深度，igv看没
$ cat positions2.bedchr1 246767467 246767469输出:$ cat position_depth2.txtchr1 246767467 246767469 1 46chr1 246767467 246767469 2 15
图2：使用的样本为 cluster0。IGV坐标中 pos=8有reads，pos=9没有reads。
结论：IGV和位点深度量化相对大小是一致的，绝对大小不一致。
- IGV 最高点是38，最低点是0。图1中IGV最高也才到66，还是低于(5)-3中的最高值80。
- IGV继续放大pos=9，还是有零星2个reads的，也比bedtools给出的低。
说明：IGV可能做了取子集？只是展示了bam的一部分？
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