概述

本文^[1]介绍了Seurat 5.0.0中的加权最近邻（WNN）分析方法，这是一种用于整合和分析多模态单细胞数据的无监督框架。

简介

多模态分析作为单细胞基因组学的一个新兴领域，它通过同时测量多种数据类型来精确描绘细胞状态，这要求开发新的计算技术。由于每种测量方式所含信息量的差异，即便是在同一组数据中的不同细胞间，也给多模态数据的分析与整合带来了挑战。在2021年发表于《Cell》杂志的一篇论文中，提出了一种名为‘加权最近邻’（WNN）的分析方法，这是一种无需监督的学习框架，它能够评估每种数据类型对每个细胞的具体贡献，从而实现对多种数据类型的综合分析。

本文介绍了WNN分析流程，它分为三个主要步骤：

• 首先，对每种数据类型进行独立的预处理和降维；
• 其次，学习每种数据类型对于不同细胞的重要性，并构建一个综合这些数据类型的WNN图；
• 最后，对WNN图进行深入分析，如可视化展示、细胞聚类等。

通过CITE-seq和10x multiome两种单细胞多模态技术，展示了WNN分析的应用。不再仅仅依据单一数据类型来定义细胞状态，而是综合两种数据类型的信息来进行定义。

CITE-seq、RNA + ADT 的 WNN 分析

利用了 Stuart 和 Butler 等人在《Cell》杂志 2019 年发表的研究中的 CITE-seq 数据集，这个数据集由 30,672 个来自骨髓的单细胞 RNA 测序样本和 25 种抗体数据组成。分析的数据包括 RNA 和抗体衍生标签（ADT）两种类型。

为了重现这个分析，需要先安装 SeuratData 包，该包可以在 GitHub 上找到。

library(Seurat)
library(SeuratData)
library(cowplot)
library(dplyr)

InstallData("bmcite")
bm <- LoadData(ds = "bmcite")

在对单细胞数据进行分析的过程中，首先独立地对两种不同的检测方法进行了预处理和降维处理。虽然采用了传统的标准化技术，但也可以根据需要选择使用 SCTransform 或其他替代技术。

DefaultAssay(bm) <- 'RNA'
bm <- NormalizeData(bm) %>% FindVariableFeatures() %>% ScaleData() %>% RunPCA()

DefaultAssay(bm) <- 'ADT'
# we will use all ADT features for dimensional reduction
# we set a dimensional reduction name to avoid overwriting the 
VariableFeatures(bm) <- rownames(bm[["ADT"]])
bm <- NormalizeData(bm, normalization.method = 'CLR', margin = 2) %>% 
  ScaleData() %>% RunPCA(reduction.name = 'apca')

通过综合考量 RNA 和蛋白质数据的相似性，为每个细胞确定了它们在数据集中的最近邻细胞。这一过程中，为每个细胞分配了特定的模态权重，并识别了它们的多模态邻居。这一计算过程是通过一个函数完成的，对于当前的数据集来说，大约需要两分钟。还对每种模态的维度进行了设定，这类似于在单细胞 RNA 测序聚类中确定要包含的主成分数量。通过调整这些参数，可以发现细微的变化对最终的分析结果影响不大。

# Identify multimodal neighbors. These will be stored in the neighbors slot, 
# and can be accessed using bm[['weighted.nn']]
# The WNN graph can be accessed at bm[["wknn"]], 
# and the SNN graph used for clustering at bm[["wsnn"]]
# Cell-specific modality weights can be accessed at bm$RNA.weight
bm <- FindMultiModalNeighbors(
  bm, reduction.list = list("pca", "apca"), 
  dims.list = list(1:30, 1:18), modality.weight.name = "RNA.weight"
)

利用这些结果，可以进行后续的分析工作，包括数据的可视化和聚类。例如，能够根据 RNA 和蛋白质数据的加权组合，生成 UMAP 图来直观展示数据。此外，还可以基于图结构进行聚类分析，并将聚类结果与细胞注释一起在 UMAP 图上展示，以便于更深入地理解细胞间的关系。

bm <- RunUMAP(bm, nn.name = "weighted.nn", reduction.name = "wnn.umap", reduction.key = "wnnUMAP_")
bm <- FindClusters(bm, graph.name = "wsnn", algorithm = 3, resolution = 2, verbose = FALSE)

p1 <- DimPlot(bm, reduction = 'wnn.umap', label = TRUE, repel = TRUE, label.size = 2.5) + NoLegend()
p2 <- DimPlot(bm, reduction = 'wnn.umap', group.by = 'celltype.l2', label = TRUE, repel = TRUE, label.size = 2.5) + NoLegend()
p1 + p2

还可以尝试仅使用 RNA 和蛋白质数据来生成 UMAP 可视化，并与之前的分析结果进行比较。发现，在识别祖细胞状态方面，RNA 分析比 ADT 分析提供了更多的信息（ADT 面板包含了用于识别分化细胞的标记）。而在识别 T 细胞状态方面，情况则正好相反，ADT 分析的表现超过了 RNA 分析。

bm <- RunUMAP(bm, reduction = 'pca', dims = 1:30, assay = 'RNA', 
              reduction.name = 'rna.umap', reduction.key = 'rnaUMAP_')
bm <- RunUMAP(bm, reduction = 'apca', dims = 1:18, assay = 'ADT', 
              reduction.name = 'adt.umap', reduction.key = 'adtUMAP_')

p3 <- DimPlot(bm, reduction = 'rna.umap', group.by = 'celltype.l2', label = TRUE, 
              repel = TRUE, label.size = 2.5) + NoLegend()
p4 <- DimPlot(bm, reduction = 'adt.umap', group.by = 'celltype.l2', label = TRUE, 
              repel = TRUE, label.size = 2.5) + NoLegend()
p3 + p4

此外，可以在多模态 UMAP 上展示标准标记基因和蛋白质的表达情况，这有助于验证已有的细胞注释是否准确。

p5 <- FeaturePlot(bm, features = c("adt_CD45RA","adt_CD16","adt_CD161"),
                  reduction = 'wnn.umap', max.cutoff = 2, 
                  cols = c("lightgrey","darkgreen"), ncol = 3)
p6 <- FeaturePlot(bm, features = c("rna_TRDC","rna_MPO","rna_AVP"), 
                  reduction = 'wnn.umap', max.cutoff = 3, ncol = 3)
p5 / p6

最终，能够直观地展示每个细胞所学习的模态权重。在这些权重中，RNA 权重最高的细胞群体通常代表祖细胞，而蛋白质权重最高的细胞群体则代表 T 细胞。这一发现与的生物学预期相吻合，因为抗体面板中并没有包含能够区分不同祖细胞群体的标记。

 VlnPlot(bm, features = "RNA.weight", group.by = 'celltype.l2', sort = TRUE, pt.size = 0.1) +
  NoLegend()

未完待续，欢迎关注！