抗体亲和力成熟制备高亲和力抗体-泰克生物

1.什么是抗体亲和力？

抗体亲和力是指抗体与抗原表位或抗原决定簇的结合强度，其实质是一种包含氨基酸间结合力——氢键、疏水性作用力等的非共价作用力。抗体亲和力的强弱取决于抗体与所用抗原表位的配合程度，其决定因素包括接触面积的大小、亲和程度以及带电基团与疏水基团的分布等。亲和力是评价抗体质量的重要指标，可以反映抗体分子和抗原分子或半抗原的结合能力。抗体与相应抗原结合的程度越高，亲和力越强。

平衡解离常数 KD(（质量摩尔浓度/升）可以评估抗体亲和力大小，其计算公式为： KD=（[Ab][H]）/[Ab•H]，其中[]表示摩尔浓度，Ab 表示抗体， H 表示抗原/半抗原，Ab • H 表示抗体与抗原/半抗原的结合物。平衡解离常数 KD 值越低，抗体与抗原/半抗原结合的能力就越高。当然，也有定义平衡解离常数的倒数为亲和力常数的做法，用亲和力常数直接表征亲和力大小。

在较短的时间内，亲和力高的抗体与抗原结合的可能性比亲和力低的抗体与抗原结合的可能性更大。因为高亲和力抗体的高活性和复合物的稳定性，高亲和力抗体在免疫化学技术中的使用效果更好——如低亲和性抗体结合小分子蛋白抗原的解离时间仅为数分钟，而高亲和性抗体解离半衰期在30min 以上。

2.什么是抗体亲和力成熟？

抗体亲和力成熟是指一种免疫功能状态。在体液免疫中，再次反应所产生的抗体比初次免疫反应平均亲和力高的现象，就称为抗体亲和成熟。具体地说——抗体由 B 细胞产生，但能产生高亲和力抗体的 B 细胞只是少数；它们发生在被称为“生发中心”的淋巴组织中，并通过一个达尔文式的演化筛选过程，从众多亲和力不同的 B 细胞中选择出来，然后分化为浆细胞（持续分泌抗体的B 细胞）。这种筛选过程被称为亲和力成熟。在这个过程中，亲和力不同的B细胞所要竞争得到的决定性因素是T细胞的帮助信号。T细胞通过与B细胞的直接接触来传递这些可以让B细胞生存、克隆增殖的帮助信号。亲和力较高的 B 细胞也更容易获得帮助信号，存活能力更好，繁殖能力更强，也更容易分化成浆细胞。

b细胞分化为浆细胞，这是由两个相互关联的过程所决定的，一是抗体特异性免疫反应的分子基础——骨髓抗体轻重链胚系的基因片段通过 V-（D）-J 的随机重排产生 106 多个组合；二是抗体结合特性，在受到抗原刺激后，在二级淋巴器官的生发中心，抗体基因尤其是互补决定区（CDR）会发生高频突变，抗体结合特性发生改变。对于高频突变，研究表明—— 胞嘧啶核苷脱氨酶（AID）可以使胞嘧啶脱氨基转变为尿嘧啶，引起碱基的错配和碱基剪切，从而导致 DNA 修复。而不正确的DNA修复会使突变产生进一步加剧，由此就可以产生高亲和力抗体。

因为只有抗原亲和力最高的 B 细胞会在树突状细胞呈递抗原后进一步分化为浆细胞和记忆细胞，所以突变区域的选择以及如何在体外抗体亲和力成熟过程中引入突变是重要问题。

体外抗体亲和力成熟是利用3D结构模拟以及在抗体V区引入合适的突变氨基酸，结合体外淘筛技术，获得经过突变后的抗体序列。

目前的突变策略主要可以分为两类：随机突变和定向突变。

类型	特点
易错PCR	* 易错PCR可以在抗体基因的全长或部分区域随机引入突变。在聚合酶对目的基因扩增时，通过应用错配率高的聚合酶或调整反应条件等，以一定的频率向目的基因中随机引入突变，并通过多轮PCR反复进行随机诱变，累计突变效应，最终获得目的蛋白的随机突变体。
DNA改组	* DNA改组技术是对同源的抗体基因，采用脱氧核糖核酸酶I将其切割成不超过50bp的片段，进行PCR扩增后再随机组合成完成的抗体基因的技术。它包含了抗体片段随机化切割、重组和筛选的过程，一定程度上模拟了天然抗体的亲和力成熟过程，并加快了体外定向进化速度。
链置换	* 链置换是保留某个特定抗体的重链或轻链，另一条链与一个随机化的互补链进行组合，经过噬菌体抗体库筛选从中筛选更高亲和力的抗体。常采用轻链替换的方法，以尽量避免链位变换后抗体结合特异性的改变，因为鼠源，人源抗体重链在抗结合活性和结构上更为重要。
定点突变	* 体细胞高频突变发生区域主要集中在与抗原直接接触的CDR区。在抗体的亲和力体外成熟过程中，CDR区是常选用的定点突变区域，对CDR进行定点突变时，可以对多个CDR进行平行突变或进行逐步优化。