摘要：

增强抗体亲和力对于提高其检测灵敏度,延长解离时间,降低药物使用剂量和增强药效都具有非常重要的意义.到目前为止,提高抗体亲和力的方法主要是以原亲本单抗为改造模板,通过构建其突变体抗体库(如核糖体展示,酵母双杂交,噬菌体展示抗体库等)进行筛选,最终获得更高亲和力的单抗.但是这些技术具有很大的局限性:很难构建出足以覆盖所有位点的,突变成任何氨基酸的突变文库;构建抗体库及其筛选过程费时费力;当目标蛋白难以表达或者在体外筛选的环境下结合不稳定的时候,就难以采用抗体库的方法进行筛选.最近,通过计算机辅助设计的方法来提高抗体亲和力的技术成为新兴的热点.与以往的抗体库技术相比,计算机辅助设计可以通过虚拟突变的方法来进行筛选,大大节约了实验所用时间;可对抗体结合域所有位点进行单点和组合虚拟突变;其预测突变的氨基酸往往只有一个就可以显著提高抗体亲和力.但现有的计算机辅助设计方法还存在准确率低和计算量过大的问题.因此,在本研究中,我们在计算机辅助设计的过程中率先引入了蛋白质相互作用,特别是抗原抗体相互作用的经验规律,借助于模拟退火及能量最小化等计算机模拟的方法,高效快速的提高了两个亲和力成熟抗体的亲和力. 在前期已获得Rituximab和CD20抗原肽共结晶的基础上,首先对Rituximab进行提高亲和力的研究.由于其对应的抗原肽仅仅为仅有44个氨基酸的短肽,其接触的溶剂化接触面积较小,在其接触表面上仅仅选取3个位置进行有目的的计算,每个位置分别突变为候选的7个其他氨基酸并进行模拟计算,通过对模拟点突变后的抗原抗体复合物进行模拟退火和能量最小化并对最终的模拟结构进行评价,最终在每个位置分别选取了3个预测提高的氨基酸,采用定点突变技术进行点突变,经测序后将序列正确的抗体轻,重链基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),最后将构建好的轻,重链表达载体共同瞬转CHO细胞并用流式细胞术检测比较各抗体突变体的亲和力.实验表明了预测亲和力提高和降低的准确率达到了75%以上.最终在每个位置上分别选取能够提高抗体亲和力的氨基酸进行组合突变,最终获得了更高亲和力的抗体.在进行Trastuzumab抗体的突变过程中,由于其与Her2抗原的接触面积较大(675A),因此在其表面上分别选取了9个位置作为候选的突变位点进行计算机模拟点突变,借助上述计算机模拟方法,随机选取了一些预测能够提高的位置进行模拟准确性的评价.借助于分子定点突变手段,最终通过流式检测亲和力的变化,证明了预测准确率达到了77%.由于采用这种基于晶体结构分析基础上选取有限的几个位置进行有限的七到八个氨基酸的突变体的计算,改变了以前通常采用的对接触面上所有的氨基酸进行突变计算突变成其他20种氨基酸的计算策略,不但大大减少了计算机运算的时间,使得以前需要在大型机上几个月的时间缩短到仅仅在图形工作站上几个星期就能够完成,而且大大提高了预测的准确率,大大缩短了进行实验摸索的时间.抗体功能的发挥不仅仅与亲和力有着密切的关系,而且与抗体的表位密切相关.通过有目的的改造,可以在不改变抗体表位的基础上,仅仅改变几个氨基酸就能够较大的提高抗体亲和力,最大限度的延长现有治疗性抗体的应用周期.对计算机辅助设计改造蛋白质亲和力的尝试,对于其在蛋白质设计领域更广泛的应用具有潜在的指导价值.

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