7+PPI+机器学习+实验，非肿瘤结合建模筛选生物标志物，可升级

今天给同学们分享一篇生信文章“Identification of diagnostic biomarkers and therapeutic targets in peripheral immune landscape from coronary artery disease”，这篇文章发表在J Transl Med期刊上，影响因子为7.4。

结果解读：

外周血中差异mRNA表达的鉴定

本研究涉及199名冠心病患者和218名对照组的外周血转录组。PCA分析显示，批次效应在三个基因集中被有效去除（图2A，B）。共鉴定出762个差异表达基因（DEGs），其中396个基因上调，366个基因下调（图2C）。前五个上调基因分别为C17orf78、TTTY21、TMEM213、COL21A1和SNX31，而前五个下调基因包括EGR3、TTTY7、TMEM196、DNAJC28和OLR1。热图显示了冠心病患者和对照组之间|logFC|> 0.2的基因，表明它们可能参与了冠心病的病理过程（图2D）。

差异表达基因的功能富集分析

为了探索这些差异表达基因（DEGs）与调控过程中涉及的生物学功能之间的关系，作者构建了蛋白质相互作用（PPI）网络。PPI分析显示这些基因在蛋白质水平上有强连接（图3A）。GO分析显示DEGs涉及分子功能、生物过程和细胞组分等方面的特征，如受体配体活性、转运复合物和细胞过程（图3B）。KEGG通路富集图显示主要富集的通路包括细胞因子-细胞因子受体相互作用、神经活性配体-受体相互作用和IL-17信号通路，表明与炎症反应和神经活动相关的功能有强相关性（图3C）。

DE-IRGs的确定和免疫相关细胞景观分析

CAD患者中的上述DEGs与IRGs交集。确定了58个CAD患者中的DE-IRGs（图4A）。与对照组相比，这些芯片中的七种免疫细胞亚群比例发现在CAD患者中有所不同。其中，激活的树突状细胞、肥大细胞、中性粒细胞、Th17细胞和MDSC在CAD中的比例增加（P < 0.05），而激活的B细胞和CD56杀伤细胞的比例减少（P < 0.05）（图4B，C）。此外，外周免疫细胞的变化之间存在相关性（图4D），例如激活的CD4 T细胞/Th2细胞（r = 0.62），巨噬细胞/肥大细胞（r = 0.55）和中性粒细胞/浆细胞样树突状细胞（r = 0.62）。

鉴定14个关键的周边CAD DE-IRGs并构建免疫诊断模型

作者通过LASSO回归减少了维度，并最终确定了14个基因来构建CAD的诊断模型（图5A，B）。通过ROC曲线评估了识别出的14个关键外周DE-IRGs的诊断性能。ROC曲线下的面积分别为CCR9（AUC = 0.686），CER1（AUC = 0.604），CSF2（AUC = 0.688），CXCL2（AUC = 0.589），HTR3C（AUC = 0.699），IL13RA1（AUC = 0.650），IL1A（AUC = 0.667），INSL5（AUC = 0.624），MBL2（AUC = 0.619），MMP9（AUC = 0.649），MSR1（AUC = 0.679），NR4RA2（AUC = 0.657），NTS（AUC = 0.667）和TNFRSF19（AUC = 0.686）（图5C，D）。然而，当所有14个基因包含在一个诊断模型中时，训练数据集和测试数据集的AUC分别达到0.968和0.859（图5E，F）。结果证明，这些组合的DE-IRGs具有良好的诊断潜力，可能也成为CAD的有希望的预防和治疗靶点。

冠心病患者的外周免疫特征分析

14个关键外周DE-IRGs在冠心病组和对照组之间显示出显著变化。其中，CCR9、CER1、CSF2、IL13RA1、INSL5、MBL2、MMP9、MSR1、NTS和TNFRSF19基因的表达上调（P < 0.05），而CXCL2、HTR3C、IL1A和NR4A2基因的表达下调（P < 0.05）（图6A）。这些基因之间显示出显著的正相关，例如CER1/NTS（r = 0.85）、CER1/IL13RA1（r = 0.79）和NTS/TNFRSF19（r = 0.94）（图6B）。考虑到多种免疫成分在冠心病诊断和病理机制中的重要作用，作者分析了免疫细胞与CAD中DE-IRGs表达之间的相互关系。例如，IL13RA1在中性粒细胞、3种类型的树突状细胞（活化、未成熟和浆细胞样）、巨噬细胞、记忆B细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、MDSC、自然杀伤细胞、肥大细胞、2种类型的T细胞（自然杀伤和γδ）和嗜酸性粒细胞中显示出强烈的上调表达（P < 0.01），而在活化B细胞、活化CD8 T细胞和CD56dim自然杀伤细胞中显示出快速的下调表达（P < 0.01）。MMP9在中性粒细胞、3种类型的树突状细胞（活化、浆细胞样、未成熟）、单核细胞、记忆B细胞、巨噬细胞、γδT细胞和嗜酸性粒细胞中表达增加（P < 0.01），并在活化B细胞、活化CD8 T细胞、效应记忆CD4/CD8 T细胞、未成熟B细胞中表达趋势下降（P < 0.01）（图6C）。

验证10个候选DE-IRGs与CAD在体内的相关性

在第20周末，病理染色（油红O）显示小鼠主动脉弓聚集了大量脂质斑块，导致管腔狭窄（图7A）。冠心病模型组的平均体重显著增加，高于对照组（P < 0.0001）（图7B）。同时，冠心病组的外周循环低密度脂蛋白（LDL）和甘油三酯（TRIG）水平显著增高（P < 0.0001）（图7C，D）。全血总mRNA检测显示，冠心病模型组的CCR9、CSF2、IL13RA1和NTS表达显著高于对照组（图7E–H，M）（P < 0.05），与在线筛选结果一致。IL1A在模型组中也有升高（P < 0.01），与在线数据结果相反（图7I）。然而，CXCL2、INSL5、MSR1、NR4A2和TNFRSF19在两组之间没有差异（P > 0.05）（图7G，J–L，N）。

IL13RA1激活JAK1/STAT3途径并调节冠心病中巨噬细胞的功能

在体外实验中，氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）上调了IL13RA1 mRNA的表达（P < 0.01），激活了JAK1/STAT3信号通路（P < 0.05，P < 0.01），并增加了骨髓源巨噬细胞中VEGF-C的产生（P < 0.01）（图8A，B-E）。在体内实验中，同样地，在20周高脂饮食诱导的LDL −/− 小鼠（冠心病小鼠模型）的主动脉中，IL13RA1 mRNA的表达、磷酸化JAK1、磷酸化STAT3、VEGF-C和IL-6蛋白水平增加（P < 0.01，P < 0.001）（图8C，D-F）。将siRNA转染到RAW264.7细胞中后（图8G），IL13RA1 mRNA的表达显著下调（P < 0.001）（图8H），导致JAK1和STAT3的磷酸化水平、VEGF-C、TGF-β和α-SMA的下调（P < 0.05，P < 0.01）（图8I，J）。IL13RA1敲除组还显示出SCARB1和ox-LDL刺激的CD36 mRNA水平下降（P < 0.001，P < 0.01）（图8M，N）。有趣的是，IL13RA1敲除增加了IL-6的产生（P < 0.0001）（图8I，J）。在ox-LDL的刺激下，上述变化趋势保持一致且更加明显。Oil red O染色结果显示，IL13RA1敲除组巨噬细胞中吸收的脂滴减少（P < 0.05）（图8K，L）。