Pooling Sequencing

1、混合（Pooling）样本测序研究

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1.1 混合测序基础

测序成本虽然下降了，但对于植物育种应用研究来说还是很高，动不动就上百群体，小小植物个体价值又低，测完了很可能后面就用不到了。这时，混合样本测序是一种省钱的好办法。

混池测序（Pool-seq）相对于GWAS或其他精细定位策略而言，其实是一个初定位产品，其结果很有可能是跟性状相关的候选区域。

概念：
混合样本测序一般是选择表型极端或目标性状差异的个体混合，构建一个文库进行测序。

原理：
假设每个样本被测到的概率相等，通过测序reads数计算等位基因频率。如果基因与研究性状有关，那么理想情况下，表型差异显著的混合样本中，该基因等位基因频率差异显著。

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不足：

大群体的等位基因频率才能代表该群体真实的情况，选择少量样本可能带来选样误差；
各样本测序量不均一引入新的偏差。
但研究表明，在大样本量混合且提高测序深度的情况下，混合样本能够准确评估等位基因频率。

影响因素及建议：

群体类型：群体类型决定研究背景是否纯，影响定位的精确性。混合样本测序最好是只有目标性状存在差异，其他性状一致，即遗传背景纯，一般永久群体>临时群体>自然群体。
混合样本量：多态性高的群体（如F2），推荐混合样本量>100；多态性低的群体（如BCF），推荐混合样本量>20；且作图群体选择比例<25%。
亲本选择：两个亲本尽量性状差异单一，杂合位点少。
混合样本的均一性：样本量小的时候影响大，样本量大影响小。
表型：表型统计不准确，或由多个微效基因控制，会引起定位效果不佳。
参考基因组：基因组组装好坏，基因组注释情况，物种连锁不平衡强易导致候选区域过大。建议采用组装到染色体水平的参考基因组。
测序错误：混合样本测序比较难通过算法区分是测序错误还是稀有变异，测序深度高能有效降低影响。
测序数据量：测序数据量推荐50X以上，测序深度高有利于检测到多态的SNP位点。
比对：混合样本无法校正比对错误，CNV会影响等位基因频率统计。

1.2 点突变检测

对于隐形纯合点突变，效果较好。

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MutMap和MutMap+是利用SNP-index算法，需要参考基因组，如果目标位点位于参考基因组没有组装上的gap区，或是参考基因组不具有的序列中，利用MutMap检测方法就不能有效检测到目标突变位点。

MutMap-Gap方法结合了MutMap和de novo组装。先通过MutMap分析SNP-index peak区，发现找不到跟突变性状相关的基因，再将之前比对不上参考基因组的野生型亲本unmapped reads和MutMap分析中SNP-index peak区域的野生型亲本比对上的reads一起进行de novo组装，获得潜在的新基因，并以此为参考再计算SNP-index，检测目标突变位点。

1.3 BSA

BSA（Bulked segregant analysis，混合分组分析），利用目标性状存在极端表型差异的两个亲本构建分离群体，在子代分离群体中，选取两组表型差异极端的个体分别构建混合池，结合高通量测序技术对混合样本测序，比较两组群体在多态位点（SNP）的等位基因频率（AF）是否具有显著差异，定位与目标性状相关联的位点并对其进行注释，研究控制目标性状的基因及其分子机制。

SNP-index是主流的BSA定位算法。其原理是构建子代分离群体，经过挑选极端性状构建混池后对SNP进行检测，对各混池进行等位基因频率分析，并与其中一个亲本进行比较。与此亲本不同的基因型所占的比例，即为该位点的SNP-index。

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注意这里的reference并不是变异检测的参考基因组，而是构建群体所使用的亲本，所以SNP-index计算高度依赖于亲本测序数据。）

两个混池相减（上图右）得到了△SNP-index的结果，即两个混池之间SNP基因型频率的差异。理论上说，不与性状相关的位点，△SNP-index的值应当在0左右，代表混池之间不存在差异；而QTL及其相连锁位置的SNP，△SNP-index值应当呈现较高的数值。

△SNP index会存在因统计偏差造成的假阳性位点，可以通过计算滑窗内所有SNP的△SNP-index，来消除其影响，得到真正QTL所在的基因组区域。

其他算法如欧几里得距离(ED)，Gradedpool-seq（Ridit检验）等。

这里的BSA是指狭义上的QTL-seq，针对有主效基因的数量性状。实际上上面的质量性状/点突变性状、InDel-seq（InDel突变性状）以及下面的BSR，都属于BSA的范畴，原理相似。此外还有QTG-seq。相应的Pipeline可参考：http://genome-e.ibrc.or.jp/home/bioinformatics-team/mutmap

1.4 BSR

BSR（Bulked segregant RNA sequencing）同样依据分组混合的原理，在RNA水平上进行高通量测序并定位候选基因，即BSA+RNAseq。BSR的混池同样选取分离群体中的极端性状单株，混池用的单株数会比BSA多一些（大多大于30），提取RNA进行混池，再进行转录组测序，mapping参考基因组后同样进行变异分析，确定候选区间。BSR的优势在于不仅提供变异信息，还能提供候选区域中基因的表达信息。

BSR的劣势：RNAseq只能检测表达基因上的SNP，检测的SNP数量少，一般只适用于高频的SNP。同时由于存在RNA编辑等问题，RNA层面检测的SNP和DNA层面也是有差别的，所以只有当DNA层面无法实现（复杂基因组）或DNA测序成本过高（超大基因组）等情况下可选择BSR，否则还是优先选择BSA。

1.5 混合样本GWAS分析

Pool –GWAS也是一种省钱策略，但还是非常小众。
比如：GWAS study using DNA pooling strategy identifies association of variant rs4910623 in OR52B4 gene with anti-VEGF treatment response in age-related macular degeneration

Pool –GWAS研究复杂遗传背景的性状功效降低，对稀有变异的检测能力下降。

1.6. 混合样本驯化研究

同样，分析获得的驯化相关位点很多，如果想用类似的方法检测复杂性状相关位点，后续挖掘真正的功能位点的难度还是很大。

1.7. 小结

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2. BSA专题——分析方法大汇总【派森诺】

https://www.sohu.com/a/414749205_120380672

在农业科学中，为了提升作物农艺性状，经常会遇到将与性状相关的基因或位点在基因组上进行定位的需求，此时BSA作为一种简便又高效的分析方法便有了大显身手的机会。可是BSA究竟是怎样的一种研究方法呢，适用于什么群体呢？跟着小编了解一下吧！

2.1 什么是BSA?

BSA（Bulked segregation analysis）即混合分组分析，也称分离群体分组分析，是指利用目标性状存在极端表型差异的两个亲本构建分离群体，在子代分离群体中，选取两组表型差异极端的个体分别构建混合池，结合高通量测序技术对混合样本测序，比较两组群体在多态位点（SNP）的等位基因频率（AF）是否具有显著差异，定位与目标性状相关联的位点并对其进行注释，研究控制目标性状的基因及其分子机制。

相较于传统的遗传学研究方法（基因定位常用分析方法，小编已经安排上啦！），BSA最大的特点是不需要对群体中的所有个体进行基因分型，而是对挑选的个体按照性状进行混合分析，所以可以极大地降低研究的工作量和成本。

2.2 什么样本适合BSA分析?

既然BSA已经兼具了简便，准确、高性价比等优点，自然也有自己的小性子了，BSA分析对使用的群体有一定要求。

1、人工构建的遗传群体（最常用来的是F2、BC、RIL）。通常来说，使用自然群体和遗传群体都可以进行BSA分析，但是考虑到遗传背景较复杂，可能导致定位结果不理想，所以不推荐使用自然群体进行BSA研究。

2、亲本目标性状差异明显，其他性状差异随机分布，所构建分离群体两个混池之间目标性状有显著差异，非目标性状无明显差异。

3、有合适的参考基因组信息。参考基因组组装的越好，信息越全，对于后续基因定位和候选区间的注释都会更加精确，可以锁定候选区间并估计候选区域的大小。没有组装到染色体级别的参考基因组，分析思路是一样的，但只能得到某个或某些scaffolds中的snp与性状相关，无法估计候选区间大小，甚至再组装结果差的情况下，无法判断基因的物理位置。

2.3 BSA有哪些分析方法？

1、SNP index及△SNP index

SNP-index作为主流的BSA定位的算法，最早在2013年被提出（Takagi）。它的基本原理是，构建子代分离群体，经过挑选极端性状构建混池后对SNP进行检测，对各混池进行等位基因频率分析，并与其中一个亲本进行比较。与此亲本不同的基因型所占的比例，即为该位点的SNP-index。从下图可以看到，两个位点的SNP-index分别为0.4和1。值得注意的是，这里的reference指的并不是我们进行重测序变异检测的参考基因组，而是我们构建群体所使用的亲本。这也是为什么进行SNP-index计算必须依赖于亲本测序数据的缘故。
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每个混池都得到一组SNP-index数据之后，两个混池相减(上图右)，即得到了△SNP-index的结果，代表的是两个混池之间SNP基因型频率的差异。理论上说，不与性状相关的位点，△SNP-index的值应当在0左右，代表混池之间不存在差异；而QTL及其相连锁位置的SNP，△SNP-index值应当呈现较高的数值。△SNP index这种分析方法会存在因统计偏差造成的假阳性位点，这时我们可以通过计算滑窗内所有SNP的△SNP-index，来消除其影响，得到真正QTL所在的基因组区域。

2、欧几里得距离(ED)

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随着BSA技术的发展，SNP-index显示出了一定的局限性，比如亲本数据缺失，林木类较难构建分析群体，ED值的分析方法应运而生。在BSA和BSR中，欧几里得距离可以计算同一个位点上，两个混池之间的等位基因频率。两个极端性状子代混池只在控制性状的QTL及其连锁位点出现差异，所以通过各个位点欧几里得距离的计算，我们可以判断哪些位点更可能是控制对应性状的QTL。计算公式如下：

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实际应用中，我们在BSA的两组混池之间可能会得到数十万甚至上百万个SNP，有的SNP可能实际与性状无关，但因为抽样偏差，导致计算得到的ED值很高，为了排除统计异常值，我们通常会采用滑窗对在一个窗口内所有位点的ED值进行拟合，消除抽样偏差产生的假阳性结果。而在BSA定位区间计算过程中，会对ED值采取乘方处理，放大ED值的差异，使定位区间更加明显。

3、 Gradedpool-seq（Ridit检验）

Gradedpool-seq的概念在2019年由韩斌和黄学辉课题组提出并发表于Nature Communication（Wang et al., 2019）。这种方法与常规BSA类似的是，它也是基于性状分离群体中按照性状选择子代个体构成混池（通常加上亲本）进行测序，并进行QTL定位的方式。Ridit是relative to an identified distribution unit一词的缩写，它是一种非参数检验分析方法，用于按等级分组资料的比较。而对于多个混池测序数据，Ridit检验会对每个位点的等位基因频率进行计算，判断其是否显著偏离标准分布，得到一个p值。换言之，这个位点的p值越小，即代表这个位点与性状相关联的可能性越高（与GWAS关联方法类似）。

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