提交高通量测序原始数据到 SRA --- 操作流程

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由于最近在提交课题数据到 NCBI 数据库，整理了相关笔记。本着自己学习、分享他人的态度，分享学习笔记，希望能对大家有所帮助。推荐先按顺序阅读往期内容：
1. 提交高通量测序数据到 GEO --- 说明书

在发表文章之前往往需要将高通量测序的数据上传到 NCBI 数据库。上传的数据可以分为两类：① Raw data（fastq文件）通常上传到 SRA、② Processed data（counts matrix、RDS 等）通常上传到 GEO。本文详细介绍提交高通量测序 raw data 到 SRA 的操作流程。

1 注册 NCBI 账号

首先需要登陆https://www.ncbi.nlm.nih.gov/account/注册一个 NCBI 账号，NCBI 支持用各种第三方账户进行注册：

2 准备要上传的原始数据

新建一个文件夹，将所有需要上传的样本的原始数据放置到同一个文件中：

3 填写数据信息

进入 NCBI 首页（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），按如下操作：① 选择 SRA、② 点击 Search、③ 点击 Submit to SRA、④ 点击 New submission

3.1 填写提交者信息（SUBMITTER）

第一项要填写提交者信息，按要求填写即可，注意*为必填选项，填写完成后点击 Continue。

3.2 填写一般信息（GENERAL INFO）

第二项要填写一般信息，如果是第一次提交 BioProject 和 BioSample 都选择 NO，Release data 建议选择靠后一些的日期，避免数据过早发布，后续可以根据课题进展修改。填写完成后点击 Continue。

3.3 填写项目信息（PROJECT INFO）

第三项要填写项目信息，填写项目标题、项目描述，如果是第一次提交选择 NO 即可，其他部分选填，填写完成后点击 Continue。

3.4 填写样本类型（BIOSAMPLE TYPE）

第四项要填写样本类型，比如小鼠样本，就选择 Model organism or animal，其他样本在选项中找到对应类型即可，填写完成后点击 Continue。

3.5 填写样本属性（BIOSAMPLE ATTRIBUTES）

第五项要填写样本属性，可以选择使用内置表格编辑器，或下载Excel和TSV模板填写后上传。

以下载的Excel表格为例：

绿色为必填项（必须全部填写），蓝色为选填项（至少选填一个），黄色为可选项（可以空着）。如果任何选项的信息在你的研究中没有涉及，可以填写 "not collected"、"not applicable"、"missing"。你也可以添加任意数量的自定义选项来完整描述你的样本信息。可以将鼠标悬停在选填名称上以查看定义，或者查看 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/biosample/docs/attributes/。

填写完成后点击 Choose file 上传，然后点击 Continue。

3.6 填写 SRA Metadata（SRA METADATA）

第六项要填写 SRA Metadata，同样可以选择使用内置表格编辑器，或下载Excel模板填写后上传。

以下载的Excel表格为例：

注意黄色列有下拉菜单，可让从下拉菜单中进行选择。蓝色为必填项，绿色为可选项。每一个选项的填写要求如下：

sample_name：样本名称，应该与前一个表格（BIOSAMPLE ATTRIBUTES）中的 sample_name 项名称相同。
library_ID：文库ID，必须是唯一的，不能重复。
title：数据集的简短描述，格式为 {methodology} of {organism}: isample info}，例如 RNA-Seq of mus musculus: adult female spleen。
library_strategy：文库策略，如 RNA-Seq。
library_source：文库来源，如 GENOMIC。
library_selection：文库选择，如 PCR。
library_layout：文库设计，single 或 paired。
platform：测序平台，如 ILLUMINA。
instrument_model：仪器型号，如 Illumina NovaSeq 6000。
design_description：设计说明，用于创建测序文库的方法的自由格式描述，简短的"材料和方法"部分。
filetype：文件类型，如 fastq。
filename：文件名，如 Sample1_R1_001.fq.gz。
filename2：文件名2，如双端测序的第二个文件 Sample1_R2_001.fq.gz。
assembly：组装，仅当您提交针对 NCBI 组装的 BAM 文件时需要，请提供 NCBI 名称或注册号(例如GRCH37)。
fasta_file：fasta 文件，仅当您提交针对 NCBI 组装的 BAM 文件时需要，提供比对过程中使用的自定义组装 fasta 文件的名称（例如 Mouse.fasta）。

填写完成后点击 Choose file 上传，然后点击 Continue。

3.7 上传文件（FILES）

第七项要上传文件。

注意事项：

上传的每个文件必须在上一步的 SRA metadata 中列出。如果您要上传 tar 存档，请列出每个文件名，而不是存档名称。
所有文件都应使用不包含任何敏感信息的唯一文件名，因为文件名会公开显示。
文件可以使用 gzip 或 bzip2 进行压缩，并且可以以 tar 存档的形式提交，但不需要存档或压缩文件。 不要使用 zip！

可以通过三种方式上传文件：

Web 浏览器上传，通过 HTTP 或 Aspera Connect 插件，但是如果您要上传超过 10 GB 或超过 300 个文件，请勿使用 Web 浏览器 HTTP 上传。
FTP 或 Aspera 命令行上传，提交的所有文件必须上传到一个文件夹中。
AWS or GCP bucket

由于原始数据通常很大，一般存储在 Linux 服务器中，因此我这里使用 Aspera 命令行上传。Aspera 提供跨越洲际距离的快速上传连接，上传速度可达 100Mb/s。

上传步骤：

下载并安装 Aspera Connect 软件，下载链接： https://www.ibm.com/products/aspera/downloads
下载 key file，下载链接： https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/preload/aspera_key/
使用以下 Aspera 命令行上传文件： ascp -i <path/to/key_file> -QT -l100m -k1 -d <path/to/folder/containing files> subasp@upload.ncbi.nlm.nih.gov:uploads/tigerzheng1998_gmail.com_M11M5vYX。
其中 <path/to/key_file> 必须是绝对路径，例如： /home/keys/aspera.openssh。 <path/to/folder/containing files> 需要指定包含所有要上传的文件的本地文件夹。

上传成功后，点击 Select preload folder 选择上传的文件夹，然后提交。

注意：上传的文件至少需要 10 分钟才能在 Select preload folder 中可供选择。请在创建文件夹后 30 天内完成提交。如果您上传文件但未提交，它们将在文件夹创建后 30 天自动删除。