嵌合抗体介绍-泰克生物

一．嵌合抗体简介

人-鼠嵌合抗体，即抗体的可变区来自鼠单克隆抗体，而恒定区则来自人的抗体。它是通过从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接,插入适当表达载体，转染宿主细胞表达产生。嵌合抗体既保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力，又大大减少了鼠源性在人体内的免疫原性，其半衰期明显延长，且在介导CDC及ADCC方面亦明显增强。

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图1 嵌合抗体示意图

二．嵌合抗体制备（关键技术与方法）

1. 可变区基因克隆

1.1 RNA提取及反转录

取对数生长期的杂交瘤细胞株约107个细胞，按照Trizol RNA提取试剂盒的说明书抽提细胞的总RNA，再进行RT-PCR扩增，回收纯化扩增产物备用。

1.2 扩增轻链、重链的V区基因

根据Orlandi等（1989）设计的扩增小鼠可变区基因的引物，以上述扩增产物为模板扩增抗体基因的可变区。回收重链VH（约360 bp）、轻链VL （约330bp）片段，插入Teasy载体，各送3份样品测序。测序所得序列在GeneBank核酸数据库中进行分类及同源性分析。

两端加入酶切位点：根据上述PCR产物序列设计含酶切位点的引物，再次进行扩增，以使抗体可变区基因片段具有与载体相吻合的酶切位点，便于插入表达载体。回收纯化扩增产物备用。

2. 嵌合抗体表达载体构建

2.1 改造含信号肽人Ig重链和轻链C区基因片段的单克隆位点

设计含重链信号肽起始位点序列及酶切位点Nhe I的上游引物HLF （KOZAK+4G,即GCCGCCATGG），和含Xho I位点的下游引物HLR，以质粒pAc-K-CH3为模板，扩增出重链信号肽基因片段；设计含XhoI和KpnI位点上游引物HCF，和含Furin（RKRR）序列及酶切位点Xba I的下游引物HCR，以质粒pAc-K-CH3为模板，扩增出重链恒定区基因片段片段；用Xho I连接上述片段得到含重链信号肽、MCS及重链恒定区的基因片段。

设计含酶切位点Apa I的上游引物LLF，和含EcoR I位点的下游引物LLR，以质粒pAc-K-CH3为模板，扩增出轻链信号肽基因片段；设计含EcoR I和Hind I位点上游引物LCF，和含Pme I的下游引物LCR，以质粒pAc-K-CH3为模板，扩增出轻链恒定区基因片段片段；用EcoR I连接上述片段得到含轻链信号肽、MCS及轻链恒定区的基因片段。

2.2 构建含信号肽及人Ig重链和轻链C区基因片段表达空载体

用合成的含酶切位点（XbaI和ApaI）的2A序列连接上述重、轻链，得到含信、号肽及人Ig重链和轻链C区基因的基因片段LigC （Leader + Ig Constant）。然后与Nhe I和Pme I双酶切过的pcDNA3.1-CA大片段连接，即得到嵌合抗体真核双表达载体 pcDNA3. 1-CA（ chimeric antibody, CA）。

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图2 pcDNA3.1图谱

2.3 插入含数源Ig重链和轻链V区基因

双酶切表达载体pcDNA3.1-CA和纯化的VL，经琼脂糖凝胶电泳分离纯化目的片段后，连接、转化大肠杆菌，筛选出pcDNA3.1-CA-VL阳性克隆，富集培养后提取质粒进行酶切鉴定。然后，双酶切表达载体pcDNA3.1-CA-VL和纯化的VH，分离纯化相应的酶切片段，重复上述步骤，构建成重组表达载体pcDNA3.1-CA-XX（抗原单词的首字母）。

3. 转染Sp2/0细胞

接种适量Sp2/0细胞于培养瓶中，培养12h后用纯化的载体pcDNA3.1-CA-XX DNA，采用Lipofectamine 2000试剂转染，按试剂盒使用说明书进行。设置空载体和无载体的细胞为对照。转染72h后，加含MTX的选择性培养基进行筛选。2周后将生长出的阳性克隆利用有限稀释法单克隆化。

4. 阳性克隆鉴定与筛选

以间接法用抗原和酶标羊抗人IgGFc片段抗体检测嵌合抗体的特异性及重组性。以适量抗原包被酶标板，加细胞培养上清反应后，再加羊抗人IgG Fc片段-HRP酶标抗体（经鼠Ig吸附过）孵育，显色后测A490吸光值。

5. 抗体腹水生产

腹腔种植转染瘤细胞，5~7天后抽取腹水。一只种植杂交瘤细胞的小鼠有时可产生多达10ml的腹水。王硕等（2003）报道称从腹水中获得的嵌合抗体产量可达1~2mg/ml。

三．嵌合抗体的应用

嵌合抗体目前主要用于药物治疗方面，与鼠抗相比，嵌合抗体既保留了鼠源可变的高亲和性，又具有人Fc段的多种免疫杀伤功能，从而大大降低了人抗鼠抗体反应的发生几率，改善了临床治疗效果，与其它小分子基因工程抗体相比，嵌合抗体作为完成的抗体分子，在体内半寿期更长，并具有人Fc段的多种免疫杀伤功能。

文章来源：

1、https://my.guidechem.com/companyNews/toCompanyNewsAddUpdate.action?companyNewsId=552735

2、https://www.tekbiotech.com

3、https://www.chem17.com/Tech_news/Detail/3587459.html