虚拟实验实验报告 - 实验报告 - 书业网

虚拟实验实验报告 - 实验报告 - 书业网

篇一：虚拟实验报告

第一章 文献综述

1.1 丙酮酸脱氢酶概述

丙酮酸脱氢酶复合体(Pyruvate Dehydrogenase Complex)催化丙酮酸不可逆的氧化脱羧转化成乙酰辅酶A。该复合体是糖酵解的关键限速酶，产物乙酰辅酶A进入三羧酸循环和氧化磷酸化。丙酮酸脱氢酶复合体在细胞能量代谢调控中的作用至关重要(Skorokhodova et al., 2011)。

在原核生物中，丙酮酸脱氢酶复合体存在于细胞质中。在哺乳动物细胞中，丙酮酸脱氢酶复合体主要定位在线粒体上，整个复合体的各个组成酶都是由核基因编码的，在核糖体上表达，转运到线粒体中。高等植物细胞有两种不同的丙酮酸脱氢酶复合体形式，一种是线粒体丙酮酸脱氢酶复合体，另一种是定位在质体基质中的质体丙酮酸脱氢酶复合体。目前认为，线粒体丙酮酸脱氢酶复合体催化反应生成的乙酰辅酶A进入三羧酸循环彻底氧化产生能量，而质体丙酮酸脱氢酶复合体催化反应生成的乙酰辅酶A则进入脂肪酸合成途径(Bhavnani and Wallace, 1990)。

1.2 丙酮酸脱氢酶结构研究

原核细胞如大肠杆菌的丙酮酸脱氢酶复合体由丙酮酸脱氢酶(E1，EC )、二氢硫辛酸乙酰转移酶(E2，EC 2)、二氢硫辛酸脱氢酶(E3，EC )组成，这三个组成酶都结合了不同的辅助因子，其中E1结合了辅助因子焦磷酸硫胺素(thiamin diphosphate，TPP)和Mg2+；E2的赖氨酸残基上共价结合了硫辛酸(lipoic acid)；E3紧密结合了FAD分子。整个复合体由24个E2单体构成核心框架结构，24个E1单体和6个E3单体结合在E2核心框架上(Bosma et al., 1982)。

真核生物的丙酮酸脱氢酶复合体除了含有上述的E1、E2、E3外，还有调节它活性的丙酮酸脱氢酶激酶(Pyruvate Dehydrogenase Kinase)、丙酮酸脱氢酶磷酸酶(Pyruvate Dehydrogenase Phosphatase)以及E3结合蛋白(E3 Binding Protein)。整个复合体核心框架结构由60个E2单体以及12个E3结合蛋白单体组成，在其周围结合有20－30个E1异型四聚体(22)、6－12个E3同型二聚体、1－2个丙酮酸脱氢酶激酶同型/异型

22四聚体的形式存在，和亚单位的分子量分二聚体以及2－3个丙酮酸脱氢酶磷酸酶异型二聚体(Kresze and Ronft, 1981)。 人丙酮酸脱氢酶复合体E1是以位点位于和别是41和36 kDa。根据人E1的X-射线晶体结构，辅助因子焦磷酸硫胺素和Mg2+的结合二个亚基之间的界面处的深沟内。

(转载于:www.zaIdian.cOM 在点 网)人丙酮酸脱氢酶复合体E2含有四个结构域：两个硫辛酸结构域(lipoyl domain)，每个硫辛酸结构域的一个赖氨酸残基上共价结合了一个辅助因子硫辛酸；一个亚基结合结构

域(subunit-binding domain)，与E1相结合；一个核心结构域(inner domain or core domain)，60个E2通过这个核心结构域结合在一起。硫辛酸结构域的赖氨酸残基侧链氨基和硫辛酸共价结合形成了一个长的“摇动的手臂”连接E1、E2和E3的活性中心，将底物和产物传送到不同的活性中心。E2的四个结构域之间由富含脯氨酸和丙氨酸的连接区域连接，连接区域的多肽链形成柔性的无规卷曲构象。人丙酮酸脱氢酶复合体中的E3结合蛋白是一种和E2类似的亚基，它由一个硫辛酸结构域、一个结合E3的亚基结合结构域以及一个核心结构域组成。目前，E2的整体三维结构还没有文献报导，只得到了它的部分结构域的三维结构，如使用X-射线散射和电子显微镜技术测定的核心结构域形成的多聚复合体的低分辨三维结构(Schulze et al., 1991)。

和真核生物不同，大肠杆菌E1是同一单体形成的非对称二聚体，E1单体由886个氨基酸残基组成。焦磷酸硫胺素和Mg2+结合在二个亚基之间的界面处，E1的 N－末端结构域(1－55氨基酸残基)三维结构无法在X-射线晶体衍射中得到，将E1的N－末端16－25、26－35、36－45氨基酸残基分别去除的突变体没有活性，而去除46－55氨基酸残基的突变体仍保持活性；同时，对E1的7－15氨基酸残基进行的点突变研究也证明E1的N-末端结构域对于整个大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合体的活性以及E1和E2之间的结合非常重要。随后的核磁共振研究发现N－末端结构域和E2的亚基结合结构域而不是硫辛酸结构域结合。利用三维结构预测软件对这55个氨基酸序列进行预测，结果显示它可能含有2个-螺旋，与E2的亚基结合结构域的-螺旋相互结合(Arjunan et