本文摘自于《肿瘤DNA甲基化标志物检测及临床应用专家共识（2024版）》

        

目录

1. DNA甲基化标志物概述

2 DNA甲基化标志物的临床检测

2.1 临床样本前处理注意事项

2.2 DNA甲基化标志物检测技术方法

2.2.1 DNA提取与纯化

2.2.2 DNA转化

2.2.3 DNA 甲基化检测平台

3 DNA甲基化标志物用于肿瘤筛查

3.1 DNA甲基化标志物

3.2 DNA甲基化标志物在多癌种筛查中的应用

3.2.1 基于全癌标志物策略的多癌种筛查应用

3.2.2 基于 cfDNA 的 DNA 甲基化标志物在多癌种筛查中的应用

3.3 DNA甲基化标志物在肿瘤筛查中的优势

4 DNA甲基化标志物用于肿瘤辅助诊断

4.1 DNA甲基化标志物用于组织病理学检测

4.1.1 DNA 甲基化用于辅助病理诊断

4.1.2 DNA 甲基化用于病理亚分型

4.2 DNA甲基化标志物用于脱落细胞学检测

4.2.1 脱落细胞甲基化标志物用于女性生殖道肿瘤的临床诊断

4.2.2 脱落细胞甲基化标志物用于膀胱癌的辅助诊断

4.2.3 脱落细胞甲基化标志物用于结直肠癌的临床诊断

4.2.4 脱落细胞甲基化标志物用于肺癌的辅助诊断

4.3 DNA甲基化标志物用于血液检测

4.3.1 结直肠癌

4.3.2 胃癌

4.3.3 肺癌

4.3.4 肝癌

4.3.5 妇科生殖道肿瘤

4.4 DNA甲基化标志物应用于肿瘤溯源

5 DNA甲基化标志物在肿瘤伴随诊断中的应用

5.1 DNAMGMT甲基化标志物辅助药物的选择

5.2 游离DNA甲基化标志物监测药物反应

6 DNA甲基化标志物用于肿瘤预后监测

6.1 DNA甲基化标志物用于评估肿瘤的微小残余病灶

6.2 DNA甲基化标志物用于肿瘤复发监测

7 小结与展望

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        在现代肿瘤治疗领域，肿瘤 DNA 甲基化标志物作为一种重要的生物标志物，在癌症的早期诊断、治疗选择及预后评估中扮演着越来越关键的角色。为了推动 DNA 甲基化标志物在肿瘤管理中的应用，提高临床医技人员及科研人员对其重要性的认识，同时规范检测流程，确保检测结果的准确性和可靠性，中国抗癌协会肿瘤标志专业委员会组织了一批领域内的专家学者，基于最新的研究成果和临床实践经验，共同编写了本专家共识。本共识系统地介绍了DNA 甲基化标志物的基本概念、检测技术、临床应用范围及其在肿瘤筛查、辅助诊断、伴随诊断、复发监测和预后评估中的作用。本专家共识旨在为临床医生、研究人员及检测人员提供一套关于 DNA甲基化标志物检测及其临床应用的指导性建议，以促进该领域的标准化发展，最终实现个性化肿瘤诊疗策略的优化，为患者的早筛、早诊以及精准诊疗提供决策依据。根据相关领域的研究进展，本专家共识将及时进行修订，以满足临床应用的需要。

        本专家共识已在国际实践指南注册平台上登记，编号为PREPARE⁃2024CN173。证据收集于PubMed、中国知网、万方和维普等数据库，以及国家药品监督管理局（NMPA）、美国食品药品管理局（FDA）、欧盟医疗器械数据库（EUDAMED）等官方公开信息（检索截至 2024 年 3 月 22 日）。所选取的研究包括国内外公开发表的系统性综述、随机对照试验、队列研究以及病例对照研究等。通过对文献进行综合分析并结合临床经验初步确定了推荐建议。本专家共识的循证医学证据等级参考牛津循证医学中心（OCEBM）的证据等级（表 1）。初步推荐建议经过专家投票，投票选项包括同意、不确定和不同意。根据专家投票结果，推荐等级分为强推荐、推荐和未达成共识三个级别，若投票同意率超过90%视为强推荐，70%~90%视为推荐，否则为未达成共识。

1. DNA甲基化标志物概述

        DNA 甲基化是一种 DNA 的共价修饰，具体是指DNA 甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）将甲基加到 DNA CpG 序列中胞嘧啶的 5'碳位，形成 5⁃甲基胞嘧啶的过程。成簇的 CpG被称为 CpG岛（CpGislands，CGIs），主要位于结构基因的启动子和第一外显子区域。DNA 甲基化标志物是癌细胞中的 DNA异常甲基化改变，这种异常甲基化贯穿于癌症发生和发展的全过程。与传统的肿瘤标志物相比，DNA甲基化标志物具有更早期、更无创、更精准等优点。因此，可以通过非侵入性方式获得的痰液、血浆、血清或尿液等样本进行 DNA 甲基化标志物检测。一些DNA甲基化异常发生在肿瘤形成的初始阶段，通过检测与肿瘤发展相关的甲基化标志物，可以辅助癌症早期诊断、评估进展风险。DNA 甲基化标志物甲基化水平的增加或降低与肿瘤预后密切相关，可用于治疗或根治性手术后评估肿瘤微小残留病灶（MRD）和监测复发。此外，DNA甲基化标志物还可作为化疗敏感性的标志，某些特定基因的甲基化可能预示着癌症对治疗的反应，可用于判断化疗药物的疗效，以更好地指导治疗方案。

2 DNA甲基化标志物的临床检测

2.1 临床样本前处理注意事项

        细胞基因组与游离 DNA（cell⁃free DNA，cfDNA）均可用于肿瘤 DNA甲基化检测，常采用组织、血液样本，也可采用尿液、浆膜腔积液、灌洗液、粪便、拭子等样本。针对不同样本类型还应注意以下事项：⑴组织样本。组织样本离体后应在低温、水合状态下保存和转运。如不能立即开展后续处理，可选择将组织置于-70 ℃及以下环境，以长期保存；或者制成石蜡包埋组织（formalin⁃fixed paraffin⁃embedded，FFPE），可于室温保存3~5年。⑵血液样本。采集血浆标本，抗凝剂选用 EDTA 或枸橼酸，不可使用肝素。检测 cfDNA时建议足量采集2×10 mL全血。溶血、脂血和黄疸标本建议重新采集。样本运输过程中应避免机械应力致血细胞破裂，气动管道运输可能增加细胞基因组 DNA 释放。目前，临床肿瘤 DNA 甲基化分析常检测的血液组分包括外周血单个核细胞（peripheral blood monocyte，PBMC）、循 环 游 离 DNA（circulating cell⁃free DNA，ccfDNA）、循环肿瘤 DNA（circulating tu⁃mor DNA，ctDNA），但不同组分的生物学特点存在差异（表 2）。采用普通抗凝采血管时，采集后至分离不宜超出4~6 h，因为后续白细胞稳定性会下降；如条件限制、延迟分离不可避免，则在 4 ℃下保存不超出24 h。采用添加防腐剂的采血管时，建议在 3 d内进行分离。转移无细胞血浆时应严格避免混入细胞及细胞碎片，并转移至低 DNA 吸附管中保存。分离待测组分前不可冷冻保存含有红细胞的全血样本，以免严重溶血。经分离后待测组分可在-70 ℃及以下长期保存，注意避免反复冻融，而且解冻过程需置于冰上缓慢进行。⑶新鲜体液及灌洗液样本。如样本含较多血液成分，可进行抗凝处理，避免室温下长时间放置。可通过高速离心及超滤技术富集分离细胞或cfDNA。经分离后，待测组分的处理同血液样本。⑷粪便样本。粪便样本含大量微生物，采集保存过程应遵循所用试剂耗材说明并尽快送检，缩短DNA抽提前非冷冻保存及运输时间。推荐使用含防腐剂保存液，以减少人源性 DNA 降解。⑸拭子样本。应使用专用采集器，采样后可置于保存液或风干保存。风干拭子室温下保存不超过 3 d，后续操作前需加入缓冲液重悬；在保存液中，拭子样本在 2~8 ℃下保存不超过7 d，-20 ℃下保存不超过30 d。

        专家共识：各类样本经采集后，应尽可能减少转运环节与耗时，及早分离检测组分。血液样本应避免溶血，不可使用肝素抗凝。检测游离 DNA时，采集量应充足，及早采用两步离心法分离无细胞血浆，分离前不可对含红细胞血样进行冻存。新鲜体液及灌洗液样本如含较多血液成分可进行抗凝处理。粪便样本推荐采用含防腐剂保存液。（推荐等级：强推荐）

2.2 DNA甲基化标志物检测技术方法

2.2.1 DNA提取与纯化

        宜根据样本类型、检测目的选择 DNA 提取纯化方法，临床常采用离心柱法和磁珠法。提取纯化应在专门区域内进行，cfDNA 与细胞、组织样本应分区处理，以避免基因组污染。推荐使用自动化提取设备，以减少批次间差异。提取后宜尽快检测，长期保存应避免反复冻融（建议≤3 次）。针对不同检材，抽提前还应注意以下操作事项：⑴组织检材。取材应选取细胞密集区域，避免出血、坏死、自溶部分。肿瘤细胞比例含量<20%时建议富集。新鲜组织块应经液氮冷冻后研磨或使用设备破碎匀浆。FFPE 样本切片厚度以 8~10 μm 为宜，脱蜡后予酶消化去除蛋白、脂质等物质，消化酶处理条件较新鲜组织浓度高（>20 g／L）、时间长（3~5 h）。⑵细胞检材。粪便、体液、灌洗液、缓冲液拭子等样本可用于富集脱落细胞，其中粪便样本应以缓冲液或裂解液充分振荡、裂解，离心去除不可溶性沉淀物后再操作。⑶cfDNA 检材。抽提过程中选用特定磁珠产品可保留较完整DNA、富集较短DNA片段，高效分离核酸有利于下游甲基化检测。cfDNA 经提取纯化后应评估片段分布，以排除基因组DNA污染。

2.2.2 DNA转化

        目前DNA转化的主流技术包括基于化学试剂的重亚硫酸盐转化和基于酶法的温和转化，而甲基化敏感的限制性内切酶技术（methylation sensitive restriction endonuclease PCR，MSRE ⁃PCR）无需转化处理。

        基于化学试剂的重亚硫酸盐转化技术通过重亚硫酸盐处理DNA，将DNA中未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），经过 PCR扩增后进一步变成胸腺嘧啶（T）而原本甲基化的 C 保持不变，通过测序后对DNA 序列的分析区分甲基化状态的不同。重亚硫酸盐转化时间短，速度快，转化效率高，但转化过程中剧烈的温度和 pH变化会导致 DNA 降解和断裂，因此此类转化技术更适用于起始量较高的样本。

        基于酶法的温和转化技术利用易位双加氧酶 2（ten ⁃ eleventranslocation methylcytosine dioxygenase 2，TET2）和 T4⁃噬菌体⁃β⁃葡糖基转移酶（thermo scientif⁃ic T4 ⁃glucosyltransferase，T4⁃BGT）进行，该技术相对温和，避免了 DNA降解和断裂，但试剂储运条件要求高，操作繁琐，反应时间长，转化效率不如化学法稳定，目前还有待进一步的临床验证。

        基于易位双加氧酶氧化和硼烷类化合物还原的新型酶法转化技术能将 甲 基 化 的 C 转 化 为 二 氢 尿 嘧 啶（dihydro uracil，DHU），通过PCR扩增转化为T，但此类技术转化效率和稳定性尚需进一步优化。MSRE⁃PCR 技术基于甲基化敏感的限制性内切酶无法切割位点中甲基化修饰序列的原理，无需对序列进行转化。因此，MSRE⁃PCR需要的起始样本要求低，比对效率高，是未来 DNA甲基化检测应用具有发展潜力的方向。MSRE⁃PCR技术操作简单，DNA损失少，但是酶切效率需要进一步优化，以保证检测的准确性。

2.2.3 DNA 甲基化检测平台

        目前临床最常用的DNA 甲基化检测平台为实时荧光定量 PCR（quantita⁃tive real ⁃time PCR，qPCR），下一代测序（next genera⁃tion sequencing，NGS）和核酸质谱也有一定应用。qP⁃CR 平台可同时检测一个或数个 DNA 甲基化标志物，因操作简单而在临床中广泛应用。qPCR平台对DNA进行转化处理后，用引物和特异性探针对所测核苷酸位点进行检测，具有简便、高效、快速、可重复等优势。数字 PCR（digital PCR，dPCR）是新兴的第三代PCR检测技术，通过将每个核酸分子分配到一个独立的空间内，对多个独立单元中的反应体系进行相互独立的扩增，并读取其反应后的荧光强度，以界定阴性和阳性及其比例。dPCR 具有绝对定量、灵敏度高、分辨率好等特点。

        NGS 可以同时进行数百个至全基因组的 DNA 甲基化检测，检测通量高，但技术和操作复杂。DNA 甲基化检测的文库构建策略分为“先建库后转化”和“先转化后建库”两种。cfDNA 检测主要包括 5 个步骤：DNA 提取、文库构建、测序、生信分析和报告解读。NGS 平台应结合客观条件和诊治需要选择不同的基因 panel，用于癌症早筛的 NGS 检测需要进行前瞻性临床试验。目前尚无获批临床使用的基于 NGS 平台的 DNA 甲基化检测产品，部分产品在注册评审过程中 或 以 实 验 室 自 建 检 测 方 法（laboratory developed test，LDT）形式进行检测服务，适用于单癌种、多癌种或泛癌的检测。

        核酸质谱平台基于基质辅助激光解吸电离飞行时间（MALDI⁃TOF）技术，可同时检测数个至数十个DNA 甲基化标志物，可实现中通量级别的稳定检测，可以获得最大500 bp范围之内全部连续的CpG位点的甲基化定量水平。部分检测机构提供 LDT检测服务，适用于单个或多个肿瘤的检测。检测时需注意避免反应体系中的 Na+、K+等盐离子残留导致核酸峰的位置漂移，样本和基质的结晶要充分，仪器的质量校准要定期校对，校准准确度在 400 ppm 及以下，分辨率在400及以上。

        专家共识：抽提纯化所得 DNA 应根据样本类型制定质量合格标准并进行评价，包括浓度、纯度和DNA完整性。cfDNA还应评估片段分布，以排除基因组DNA污染。DNA甲基化检测需要针对不同的标本类型与检测应用选择适宜的转化方法，并关注转化技术的最新进展。qPCR具有高效、迅速、操作简便等优势；基于NGS平台的DNA甲基化检测通量高，但操作复杂且成本较高；核酸质谱平台是一个在通量、价格、时间等方面均介于 PCR 和 NGS 技术之间的平台。DNA甲基化检测平台的选择需要针对标志物数量、临床应用场景及检测条件进行综合评估。（推荐等级：强推荐）

3 DNA甲基化标志物用于肿瘤筛查

3.1 DNA甲基化标志物

        在单癌种筛查中的应用利用外周血进行 cfDNA 甲基化检测是近年来针对肿瘤早期进行无创诊断的重要方式。2008年已有研究证实结肠癌组织 SEPTIN9 基因启动子存在不同程度甲基化，并提出外周血SEPTIN9 甲基化可用于结直肠癌（colorectal cancer ，CRC）早期筛查。2024年，《新英格兰医学杂志》连发两篇关于 CRC 无创筛查的研究成果，其中一款基于血液 cfDNA 基因组变异、DNA甲基化状态和碎片组模式的 CRC早期筛查工具Shield，在ECLIPSE研究中诊断CRC的敏感性为 83.1%（95%CI：72.2%~90.3%），特异性为89.6%（95% CI：88.8%~90.3%）。 通 过 检 测 LASS4、LRRC4、PPP2R5C 和ZDHHC1基因甲基化筛查，CRC的BLUE⁃C研究显示，其检测敏感性为 93.9%（95%CI：87.1%~97.7%）；检出晚 期 癌 前 病 变 的 敏 感 性 为 43.4%（95%CI：41.3%~45.6%），对非肿瘤性发现或阴性结肠镜检查的特异性为 92.7%（95%CI：92.2%~93.1%）。国内一项纳入1 381 例患者的多中心前瞻性研究证实 RNF180 和SEPTIN9基因甲基化是理想的胃腺癌标志物，对早期胃癌（Ⅰ期、Ⅱ期）的检测灵敏度远高于 CEA、CA199、CA125等传统的蛋白肿瘤标志物。《中国早期胃癌筛 查 检 验 技 术 专 家 共 识》首 次 提 出，RNF180 /Septin9基因甲基化检测可用于早期胃癌筛查，联合检测 RNF180、Septin9 基因甲基化和肿瘤标志物可进一步提升胃癌筛查的灵敏度。通过在肺泡灌洗液中联合 SHOX2和 RASSF1A甲基化检测对肺癌的总体诊断结果均优于单纯的细胞学检查，对肺癌的早筛早诊具有积极的临床意义。采用外周静脉血进行靶向DNA 甲基化测序，构建 PulmoSeek模型用于辅助临床医生建立肺结节良恶性诊断模型，有助于提高早期肺癌的诊断。国内研究团队通过 cfDNA 的 DNA 甲基化水平构建早期肝癌诊断预测模型，结果发现基于 cfDNA 甲基化的预测模型对早期肝癌的灵敏度和特异度均优于传统血清标志物。

        DNA 甲基化技术也可以应用于宫颈癌筛查的高危分流，能对人乳头瘤病毒（HPV）阳性患者进行初步分流。上海交通大学附属国际和平妇幼保健院团队建立了纳入3 251例hrHPV阳性女性的前瞻性研究队列，对 HPV 检查的剩余样本进行 PCDHGB7基因甲基化检测，与细胞学检测相比，PCDHGB7甲基化检测减少了 62.2% 的非 16/18 型高危 hrHPV 阳性女性的转诊，显示出更为优越的特异度（92.1% vs 74.9%）。

        专家共识：DNA甲基化技术为肿瘤早筛提供了一种高效、非侵入性且具有广泛应用潜力的筛查方法，实现了对结直肠癌、胃癌、肺癌、肝癌和宫颈癌的早诊早筛（证据等级：2级；专家推荐等级：推荐）。

3.2 DNA甲基化标志物在多癌种筛查中的应用

        随着癌症筛查技术的不断进步，临床上主要有两种多癌种筛查策略，第一种是以全癌标志物为代表的单一标志物的全癌种筛查，第二种是结合了组织溯源技术的多个肿瘤标志物组合筛查策略。

3.2.1 基于全癌标志物策略的多癌种筛查应用

        应用导航定位测序（guide positioning sequencing，GPS）技术，通过对全基因组 DNA 高精度和高覆盖度的甲基化位点进行筛查，于文强团队挖掘了基于 DNA 甲基化位点的全癌标志物，这类 DNA 甲基化标志物可用于多种癌症的筛查，其中通过全基因组 DNA 甲基化数据挖掘的 HIST1H4F 基因在 17 种癌症中呈异常高甲基化。该团队筛选的全癌标志物 PCDHGB7 在不仅在 TCGA 数据库的 17 种癌症类型中都呈高甲基化，后续还在 13 种临床肿瘤样本中得到验证。SIX6基因在10种常见癌症类型的 678 份临床样本表现出普遍的高甲基化，其中，SIX6 基因高甲基化诊断宫颈癌、子宫内膜癌及尿路上皮癌的 ROC 曲线下面积（area under the curve，AUC）分 别 为 0.99、0.94 及0.93，表明 SIX6 高甲基化是肿瘤进展的早期事件，可以应用于肿瘤的临床早期筛查。

3.2.2 基于 cfDNA 的 DNA 甲基化标志物在多癌种筛查中的应用

        基于 cfDNA 的 DNA 甲基化标志物由于其非侵入性特性已成为癌症早期诊断有前途的生物标志物。一项针对 cfDNA 测序技术在肿瘤早筛中应用的研究显示，cfDNA甲基化是预测癌症信号来源的最佳标志物，甲基化分类器具有最高的肿瘤检测灵敏度。在多癌种早检研究THUNDER中，对血液中的cfDNA进行靶向甲基化检测，检测结直肠癌、食管癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌等 6 种肿瘤的敏感性为69.1%，特异性为98.9%。随着技术的发展，cfDNA甲基化与其他组学信息的整合极大地提高了肿瘤早期筛查的准确性。Van Thien Chi Nguyen 研究团队应用 cfDNA 甲基化组学和片段组学信息，在乳腺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌和肺癌等5类肿瘤中进行诊断验证，敏感性为72.4%、特异性为 97.0%。清华大学研究团队通过 cfDNA 甲基化特征构建SRFD⁃Bayes诊断模型，在乳腺癌、结肠腺癌、肺鳞癌、肺腺癌、肝细胞癌和前列腺癌等肿瘤中进行验证，该模型对肿瘤定位的平均准确率为 76.9%，肿瘤早期检测的敏感性为86.1%，特异性为94.7%。

        专家共识：通过检测一种或几种在多种癌症中普遍存在的 DNA甲基化标志物能够快速地对多种癌症进行初步筛查。这种方法适用于大规模的人群筛查，尤其是在资源有限的情况下，可以作为一种经济、有效的筛查手段。此外，结合了组织溯源技术的多个肿瘤标志物组合筛查策略，提供了更为精确的筛查结果，但这种策略的技术要求及成本更高。在选择适合的癌症筛查策略时，医疗专业人员需要综合考虑筛查的目的、目标人群的特点、可用的医疗资源以及患者的具体情况。（证据级别：2级；专家推荐等级：强推荐）

3.3 DNA甲基化标志物在肿瘤筛查中的优势

        DNA甲基化标志物在肿瘤筛查中有几大优势：⑴具备肿瘤特异性。在不同的肿瘤阶段，DNA甲基化位置和甲基化水平存在差异，而异常的 DNA 甲基化是肿瘤的特征之一。⑵发生在肿瘤早期甚至癌前病变阶段。这些 DNA甲基化的表观遗传变化大部分发生在肿瘤的早期，并持续存在于肿瘤发展全程，且在全部肿瘤类型中普遍存在。⑶可以液体活检。肿瘤组织中的 DNA 甲基化片段可以释放到血液和体液中，以 ctDNA 的形式存在，并可在血液中被稳定地检测。⑷不受干扰。克隆造血导致的突变对检测血液中ctDNA的突变造成很大的影响，而检测 ctDNA的甲基化不受影响。因此，在基于血液 ctDNA 的液体活检中，检测ctDNA甲基化比检测ctDNA突变更准确。

4 DNA甲基化标志物用于肿瘤辅助诊断

4.1 DNA甲基化标志物用于组织病理学检测

        病理诊断（包括细胞和组织病理学检查）可能会受标本质量和病理学家诊断水平的影响，新兴的分子诊断方法如 DNA 甲基化检测具有良好的组织特异性，更加敏感和客观，可以克服形态学诊断的固有缺陷。

4.1.1 DNA 甲基化用于辅助病理诊断

        国内肺癌研究数据显示，在病理诊断模棱两可的时候，穿刺活检 FFPE 样本的 SHOX2 和 RASSF1A 甲基化检测的特异性为 90.4%，敏感性为 89.8%。甲状腺癌也是我国高发癌种，甲状腺穿刺的形态病理诊断也是工作难点，利用甲基化芯片可以有效区分甲状腺良恶性病变，敏感性为 94.3%，特异性为 82.4% 。TIMP3、RARB2、SERPINB5、RASSF1、TPO 和 TSHR 等 6种基因甲基化组合在区分甲状腺乳头状癌和正常甲状腺组织时表现出91%的敏感性和81%的特异性。乳腺穿刺样本可以通过 10个甲基化指标的检测组合进行良恶性区分，AUC 值达 0.960。前列腺穿刺可以使用PITX2甲基化辅助诊断。穿刺病理联合甲基化检测作为辅助诊断可以进一步提升诊断效力，减少漏诊。

4.1.2 DNA 甲基化用于病理亚分型

        不同病理亚分型与患者的治疗方案及预后密切相关，DNA甲基化标志物用于分子分型，也可以作为评估肿瘤侵袭性的方式之一。脑胶质瘤是临床上常见的一类颅脑肿瘤，其构成比在脑肿瘤中高达 60%。《2020 版美国国立综合癌症网络脑胶质瘤临床实践指南》指出MGMT基因启动子甲基化是所有高级别脑胶质瘤（Ⅲ级和Ⅳ级）分子诊断的重要部分，其启动子甲基化是脑胶质瘤患者预后的独立预测因子。2019年，NMPA批准石蜡组织切片MGMT基因甲基化诊断试剂盒应用于临床。国外研究团队创建了一个中枢神经系统肿瘤分类器，该分类器中 76% 的病理形态学和甲基化分级一致，12%的病例根据甲基化图谱获得了修订诊断。

        专家共识：肿瘤 DNA 甲基化检测可以在病理诊断困难的标本中辅助提高诊断准确性（证据级别：3级，推荐等级：强推荐）。肿瘤 DNA 甲基化标志物能进行更精确的分子分型，指导治疗和预后评估，如MGMT启动子甲基化检测（证据级别：1级；推荐等级：强推荐）。甲基化分类器模型应用在中枢神经系统肿瘤分子分型中将进一步提高其病理诊断的准确性。

4.2 DNA甲基化标志物用于脱落细胞学检测

        目前常见的含有肿瘤脱落细胞的标本类型主要有脑脊液、胸腔积液、腹腔积液、尿液、肺泡灌洗液等体液，以及粪便、宫腔表面刷取物、痰液等。

4.2.1 脱落细胞甲基化标志物用于女性生殖道肿瘤的临床诊断

        女性生殖道内腔的通畅性让刷取宫颈脱落细胞进行无创分子检测子宫颈癌、子宫内膜癌成为可能。上海交通大学附属国际和平妇幼保健院团队对宫颈脱落细胞学检查的剩余样本进行PCDHGB7基因甲基化检测，PCDHGB7检测≥宫颈高级别鳞状上皮内瘤变的敏感性和特异性分别为 82.1% 和 88.7%，检测宫颈癌的 AUC为 0.97。两项中国大型临床研究分别使用 PCDHGB7 甲基化和 PAX1 甲基化进行高危型 HPV 阳性女性的分层管理，诊断的敏感性分别为 82.4% 和 76.9%，特 异 性 分 别 为 91.1% 和91.6%。国内外研究与专家建议，推荐子宫颈癌DNA甲基化筛检临床路径（图1）：⑴HPV阳性高风险或细胞学异常女性的分层管理；⑵ 宫颈Ⅲ型转化区与潜在腺癌病人风险评估；⑶病变（癌）治疗后监测；（4）退出宫颈癌筛查计划的评估。40%~50%的子宫内膜癌患者的宫颈脱落细胞可检测到子宫内膜癌细胞，这让使用脱落细胞进行内膜癌甲基化早期诊断具临床可行性。通过宫颈口脱落细胞检测子宫内膜癌，PCDHGB7甲基化对早期（Ⅰ期）子宫内膜癌诊断的敏感性为 85.71%，特异性为80.60%，目前基于该基因的检测产品已获得欧盟CE 认证。CDO1 和 CELF4 甲基化检测的敏感性和特异 性 分 别 为 87.5% 和 90.8%，BHLHE22 / CDO1 /HAND2 的 敏 感 性 和 特 异 性 分 别 为 87.0% 和86.0%。卫生棉条收集阴道样本与医师采样可达到一致的DNA甲基化检测水平。国内外研究与专家建议，推荐子宫内膜癌 DNA 甲基化筛检临床路径：⑴影像学联合甲基化筛检；⑵生殖道出血分层管理；⑶子宫内膜癌高风险人群筛查。

图1 子宫颈癌DNA甲基化检测建议流程图

4.2.2 脱落细胞甲基化标志物用于膀胱癌的辅助诊断

        国内目前针对人尿液脱落细胞检测试剂盒有2款被NMPA 批准，分别是人类 TWIST1 基因甲基化检测试剂盒和人类 ONECUT2 / VIM 基因甲基化检测试剂盒，检测敏感性分别为 88.2% 和 91.2%；特异性分别为 86.8% 和 85.7 %。一些基于尿液脱落细胞甲基化检测早期膀胱癌的产品被 FDA/CE 批准上市DNA，如AssureMDx（MDx Health，Irvine，CA，USA）及TAGMe®（Epiprobe，Shanghai，China）。AssureMDx 检测膀胱癌敏感性为 93%，特异性为 86%，TAGMe®检测尿液中SIX6甲基化的状态，其诊断尿路上皮癌的敏感性为86.67%，特异性为 90.80%，该产品已获欧盟 CE 认证，并于2023年获得FDA的“突破性医疗器械认定”。

4.2.3 脱落细胞甲基化标志物用于结直肠癌的临床诊断

        2014 年，FDA 批准全球第一款基于粪便脱落细胞 DNA 检测的肠癌早筛试剂盒 Cologuard，用于结直肠癌高危风险人群筛查。其包含有免疫法粪便潜血试验、KRAS突变检测、NDRG4和 BMP3基因的甲基化检测。国内多款粪便脱落细胞甲基化检测试剂盒也是基于这些指标进一步改善和提高试剂盒的诊断效能。针对国产试剂盒的研究数据表明，粪便基因甲基化检测对Ⅰ、Ⅱ期结直肠癌的诊断敏感性可达95.45％，特异性为 81.6％，适合用于其辅助诊断。粪便基因甲基化检测存在的问题包括患者的依从性差、样本现场获取困难、异质性高以及粪便样本检测科室接受度差等。居家采样结合实验室检测的模式可能更适合粪便样本检测。

4.2.4 脱落细胞甲基化标志物用于肺癌的辅助诊断

        国内相关研究显示，肺泡灌洗液中联合 SHOX2和 RASSF1A 甲基化检测对肺癌的总体诊断敏感性和特异性分别为 72.8% 和 87.1%，敏感性显著高于细胞学检查。该试剂盒已被 NMPA 批准用于肺癌高风险人群辅助诊断。通过检测肺泡灌洗液样本中的HIST1H4F 甲基化水平诊断肺癌，其特异性为 96.7%，敏感性为 87.0%，其中针对Ⅰ~Ⅱ期肺癌的敏感性为82.6%~84.5%。有团队构建基于胸水脱落细胞的PCDHGB7 甲基化诊断模型，判断肺癌是否出现胸膜转移的敏感性为94.21%。

        专家共识：脱落细胞DNA 甲基化检测是一种新型的、便捷的、无创的辅助癌症早筛早诊工具。脱落细胞甲基化检测辅助宫颈癌、膀胱癌、结直肠癌及肺癌诊断已获NMPA批准，具备临床可行性，但仍需要在国内更多临床数据验证下完善 DNA甲基化标志物使用的临床路径（证据等级：2级；专家推荐等级：强推荐）。

4.3 DNA甲基化标志物用于血液检测

        血液中的 DNA 甲基化标志物可以在癌症发生早期被检测到，且伴随癌症发展和治疗过程。国内外已经有大量的研究在不同癌种中对血液检测 DNA甲基化标志物进行探索，以期能够辅助癌症诊断。

4.3.1 结直肠癌

        研究显示外周血中甲基化SEPTIN9有助于辅助诊断结直肠癌，敏感性为 80.0%，特异性为95.3%，联合免疫法粪便潜血试验（FIT）可进一步提高结直肠腺瘤的检出率。此外，结直肠癌患者血浆样本中 Septin9、SDC2 及 BCAT1 三种基因启动子区域呈高甲基化水平，Septin9联合SDC2、BCAT1具有较好 的 辅 助 诊 断 价 值 ，敏 感 性 为 82.7%，特 异 性 为96.9%，进一步联合 FIT 和 CEA，其 AUC 为 0.962。上述基因检测试剂盒已被 NMPA 批准用于疑似结直肠癌患者的辅助诊断。

4.3.2 胃癌

        SEPTIN9与RNF180基因甲基化在胃癌患者血浆样本中显著升高，胃癌检测的敏感性为61.76%，特异性为 85.07%。该基因谱检测试剂盒已被 NMPA 批准用于胃癌家族史或 40岁以上胃癌高风险人群的检测。RNF180、SEPTIN9 基因甲基化联合其他肿瘤标志物可进一步提升胃癌诊断敏感性，一项前瞻性队列研究结果显示 RNF180、SEPTIN9 联合CA72⁃4检测的总敏感性为68.6%。

4.3.3 肺癌

        肺癌患者血浆中 SHOX2 甲基化水平显著升高，诊断敏感性为60%，特异性为90%，相较于肺腺癌，其诊断小细胞肺癌（80%）和鳞状细胞癌（63%）具有更高的敏感性。SHOX2、RASSF1A 及 PTGER4等 3 种基因联合检测表现出良好的区分恶性和良性肺病的性能，敏感性为 87.0%，特异性为 98.0%，上述基因谱检测试剂盒已被 NMPA 批准用于疑似肺癌患者的辅助诊断。

4.3.4 肝癌

        国内一项临床研究通过检测肝癌患者血浆ctDNA中的BMPR1、PLAC8、ATXN1及KLF3等10个基因的甲基化水平，诊断肝癌的敏感性为 83.3%，特异性为 90.5%。目前 BMPR1和 PLAC8基因甲基化试剂盒已被 NMPA 批准用于疑似肝癌患者的辅助诊断。还有研究发现在肝细胞癌患者 ctDNA 中存在大 量 独 立 的 高 甲 基 化 基 因 位 点 ，如 DBX2、THY1、TGR5、MT1M、MT1G、INK4A、VIM、FBLN1、RGS10、ST8SIA6和RUNX。

4.3.5 妇科生殖道肿瘤

        相比于现在广泛使用的CA125，cfDNA 甲基化标志物的优势在于从平均风险人群中识别出早期卵巢癌患者。一项研究使用APC、RASSF1A、CHDH1、RUNX3、TFP12、SRP5和OPCML等7种基因的组合甲基化检测卵巢癌，该组合检测卵巢癌的特异性为 90.57%，其中检测早期卵巢癌的敏感性为85.37%，而CA125的敏感性仅为56.10%，特异性为64.15%。

        专家共识：血液 DNA 甲基化标志物检测辅助癌症诊断的证据越来越多，尤其是 DNA 甲基化标志物在结直肠癌、胃癌、肺癌、肝癌的辅助诊断PCR试剂盒已经在国内获批，但是还需要针对现有的产品不断进行技术优化，确保 DNA 甲基化检测的可重复性和稳定性（证据等级：2级；专家推荐等级：强推荐）。DNA甲基化检测在卵巢癌中同样具有较好的应用前景，但尚未成熟（证据等级：3级；专家推荐等级：强推荐）。

4.4 DNA甲基化标志物应用于肿瘤溯源

        原发灶不明恶性肿瘤（carcinoma of unknown pri⁃mary，CUP）是一类经病理学诊断为转移性恶性病灶，但是经过常规检查和评估仍不能确定原发部位的异质性肿瘤，占全部肿瘤病例的 3%~5%。越来越多的研究证据表明通过对肿瘤甲基化状态的检测，可以实现对肿瘤原发部位的溯源。FERNANDEZ 等通过对 1 628 例肿瘤患者组织标本的甲基化图谱分析，鉴定并识别出 24 种肿瘤特异性的甲基化改变模式，能用于CUP的肿瘤类型溯源。MORAN等构建的基于组织 DNA 甲基化谱的肿瘤类型分类器（EPI⁃CUP）在 7 691 个肿瘤的验证集中显示出 99.6% 的特异性和 97.7% 的敏感性，DNA 甲基化谱预测了 216例CUP 患者中的 188 例（87%）的原发来源。ZHU 等利用组织特异性单细胞 RNA测序数据集构建了一个定义为 13 种实体组织类型和 40 种细胞类型的 DNA甲基化图谱，结果显示该图谱能够正确地预测不同肿瘤类型的起源细胞。cfDNA 甲基化已被证明是非常有前途的特征性标志物，不仅能检测癌症，还能定位其组织来源。一项针对 cfDNA 的测序分析技术在肿瘤早筛中的临床研究，准确预测了 75%（95/127）肿瘤样本的组织信号来源。还有研究开发了组织特异性DNA甲基化标志物，其中肝源性 DNA 绝对浓度为能更好地区分结直肠癌肝转移患者和无肝转移患者。STACK⁃POLE 等开发了基于 cfDNA 的肿瘤溯源方法并应用于 408例结肠癌、肝癌、肺癌和胃癌患者及对照组，在97.9%的特异性下，检测全期和早期癌症的敏感性分别为 80.7% 和 74.5%，溯源全期和早期癌症的准确率分别为89.1% 和 85.0%。

        专家共识：肿瘤溯源是肿瘤临床诊疗的重要工作，可为肿瘤精准治疗提供依据。有别于传统溯源方法，基于组织标本或 cfDNA 的 DNA 甲基化检测在肿瘤溯源领域展示出良好的应用前景，但目前尚无获批检测试剂用于临床，后续仍需积累充分的临床验证数据，以建立健全的数据库和优化检测算法，进一步提高溯源技术的灵敏性和特异性（证据等级：3级；专家推荐等级：强推荐）。具体临床实践中仍需结合组织病理进行肿瘤溯源。

5 DNA甲基化标志物在肿瘤伴随诊断中的应用

5.1 DNAMGMT甲基化标志物辅助药物的选择

        启动子区域甲基化水平可用于评估脑胶质瘤对替莫唑胺的敏感性，对替莫唑胺的敏感性高于甲基化阴性的患者启动子甲基化阳性的患者。RASSF10 基因甲基化可能是肝癌对多西他赛耐药的标志；QPCT 启动子区域的甲基化程度及 QPCT 的表达水平可以作为预测肾癌对舒尼替尼敏感性的生物学标志物；p16 甲基化是预测胃癌对阿贝西利（Abemaciclib）敏感性的潜在标志物；TROP2 甲基化可预测乳腺癌对他莫昔芬耐药；ERCC1和MGMT基因甲基化可作为结直肠癌患者对 FOLFOX 反应的预测标志物；HSP70 甲基化通过与 BCL2 mRNA 结合使其稳定，导致胰腺癌细胞对治疗产生耐药。

5.2 游离DNA甲基化标志物监测药物反应

        随着生物信息学的进步和 cfDNA 甲基化检测技术的不断成熟，目前已经建立了癌症特异性甲基化模式，使通过检测cfDNA甲基化（血液或其他体液）进行动态监测药物反应成为可能［88⁃89］在接受新辅助化疗和/或手术的非小细胞肺癌中，RASSF1A 和 RARβ2 甲基化会下降到健康受试者水平，提示动态检测 DNA甲基化水平可以监测其治疗反应。在接受顺铂化疗的肺癌患者中，24 h 内 APC 和/或 RASSF1A 甲基化水平增加与总生存期（overall survival，OS）增加相关。临床观察发现，对化疗和（或）放疗有反应的晚期肺癌患者在开始治疗后 7~10 d内血浆中 SHOX2甲基化水平下降，且治疗前和治疗后 7~10d 的高 SHOX2 甲基化水平与较短的 OS 相关。在妇科肿瘤中，通过检测 cfDNA 中 MLH1 的甲基化水平可预测卵巢癌患者对铂类药物的敏感性；通过检测HOXA9和RAD51C基因的甲基化水平可预测PARPi的治疗效果；而检测KANSL1甲基化水平可预测卵巢癌的免疫治疗疗效。

        专家共识：MGMT基因甲基化水平与脑胶质瘤药物替莫唑胺的敏感性密切相关，该基因的甲基化检测已经成熟应用于临床（证据等级：1级；专家推荐等级：强推荐）。一些基因的 DNA 甲基化水平与肝癌、胃癌、乳腺癌、肾癌、结直肠癌及胰腺癌的药物敏感性有关，但仍需更多临床试验进一步验证（证据等级：3级；专家推荐等级：强推荐）。通过检测 cfDNA 的甲基化水平，可以动态监测肺癌和卵巢癌患者对治疗方案的反应，但不同癌种的治疗方式存在差异，且DNA甲基化评分标准也不同，在临床应用前需要建立相应质控标准（证据等级：2级；专家推荐等级：强推荐）。

6 DNA甲基化标志物用于肿瘤预后监测

6.1 DNA甲基化标志物用于评估肿瘤的微小残余病灶

        经手术或治疗后的 MRD 是肿瘤复发的主要原因。DNA甲基化标志物用于MRD分析时不需要获得原发肿瘤特征性的突变信息，其灵敏度不依赖于患者高频突变数量，对 MRD 检测具有很大的潜力。目前，已有证据证实 DNA 甲基化标志物可应用于 MRD检测，以此识别术后高复发风险人群，以筛选辅助治疗获益人群，避免复发低风险患者承受过度的治疗。基于 LUNAR⁃1 研究结果，利用 ctDNA 突变联合ctDNA甲基化对结直肠癌患者进行MRD检测及复发监测，与单独 ctDNA 突变相比，整合 ctDNA 甲基化分析的敏感性提高 25%~36%。一项前瞻性Ⅱ~Ⅲ期临床试验（注册号：NCT00958737）纳入 805 例结直肠癌患者分析了手术前后血浆样本中 ctDNA 甲基化标志物（WIF1和 NPY）评估 MRD 与肿瘤复发的关系，发现 ctDNA 阴性组 2 年无病生存率明显高于 ctDNA 阳性组（82% vs 64%）。另一项Ⅱ~Ⅲ期回顾性研究纳入87例乳腺癌患者，经新辅助化疗后，患者血浆中ctDNA基于RASSF1A启动子的超甲基化（met⁃ctDNA）水平与残余肿瘤负荷程度显著相关（P=0.008）；同时，术后 1 年 met⁃ctDNA 阳性患者中（7 例）有 3 例出现肿瘤复发，而met⁃ctDNA阴性患者均未出现。

        专家共识：基于 ctDNA 甲基化标志物的 MRD 分析不需要对肿瘤组织进行测序以获得原发肿瘤的特征性突变信息，并且不受克隆造血导致的突变干扰，可用于结直肠癌和乳腺癌患者术后或其他治疗完全缓解后的 MRD 检测，有望成为肿瘤患者预后风险管理的关键工具（证据等级：2 级；专家推荐等级：强荐）。DNA 甲基化标志物在 MRD 分析上的应用潜力远未完全挖掘，仍需大量的临床数据来支持其扩展至更多癌种，并对现有的技术流程和内容进行深入优化，以进一步提高其临床应用价值。

6.2 DNA甲基化标志物用于肿瘤复发监测

        cfDNA 较短的半衰期使其与肿瘤细胞演进状态密切相关，也使其用于肿瘤复发的动态监测成为可能。在一项肝癌的大队列临床数据研究中，通过整合全基因组甲基化水平、临床大数据分析和机器学习，建立了含有8个甲基化标志物的肝癌预后预测模型，生存曲线显示高风险组生存率均明显低于低风险组，且该预测模型对预后的评估能力优于临床分级。类似地，基于 ctDNA 甲基化标志物的机器学习算法用于 CRC 患者的预后判断研究发现，治疗后肿瘤残留患者及复发患者的评分较高，此外预后预测模型还能有效预测 CRC 患者的预后和生存期。还有一项针对Ⅰ~Ⅲ期 CRC的多中心、前瞻性队列研究纳入了299例患者，分析手术前、手术后、辅助化疗时及化疗结束后血浆中 6 种 ctDNA 甲基化标志物水平，结果发现术后 1个月 ctDNA甲基化阳性患者的复发风险是阴性患者的17.5倍，而且该甲基化检测提示复发转移早于影像学证据，中位期提前 3.3个月［102］。在 CRC 中，cfDNA 甲基化标志物结合血清 CEA 构建评分体系可在临床或影像学发现复发灶之前预测复发，提前的中位天数为 106 d（范围：90~232 d）。在前列腺癌患者中，多西他赛治疗两个周期后检测不到血清GSTP1甲基化的患者生存时间更长，提示血清游离 GSTP1 甲基化可能是一种有潜力的临床试验替代终点和临床决策工具。

专家共识：DNA 甲基化标志物可用于评估肝癌、结直肠癌及前列腺癌等肿瘤进展及复发的动态监测，优化患者风险分层及治疗措施（证据等级：2级；专家推荐等级：强推荐）。常规复发监测标志物与DNA甲基化预测模型相结合可进一步提升预测效能。

7 小结与展望

        癌症是全球死亡的主要原因之一，对癌症的“早发现、早诊断、早治疗”可以降低所有类型癌症的死亡率。目前，表观遗传学领域的研究正处于蓬勃发展之中，其中DNA甲基化标志物的研究尤为突出，其研究方向包括：⑴深入探讨DNA甲基化的调控机制，研究不同甲基化状态下肿瘤的发生、发展以及对治疗的耐药性差异，为后续 DNA 甲基化标志物的开发提供更加扎实的理论依据；⑵在技术层面，致力于开发新型甲基化转化、甲基化检测技术和方法，以提升检测的特异性和敏感性，并且为临床应用铺平道路；⑶开发组合的生物标志物，将多种 DNA 甲基化标志物结合或与其他类型的生物标志物结合使用，最终构建更可靠的生物标志物模型；⑷利用机器学习和深度学习算法对 DNA 甲基化数据进行预测分析，构建复杂的算法和模型，从海量的甲基化数据中识别出具有诊断或预后意义的甲基化标志物。本专家共识全面梳理了DNA甲基化标志物的检测技术、临床应用及其在肿瘤管理中的潜力，提出了一系列具有前瞻性和实践指导意义的共识推荐。未来，期待本共识进一步落地和实践，为患者的健康保驾护航，为医学领域发展贡献更多的智慧和力量。

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