文献解读-肿瘤测序-第六期|《基于CRISPR/Cas9技术的肿瘤突变负荷测量新参考物质的开发》

关键词：肿瘤测序；基因组变异检测；

文献简介

标题（英文）：Development of a Novel Reference Material for Tumor Mutational Burden Measurement Based on CRISPR/Cas9 Technolog
标题（中文）：基于CRISPR/Cas9技术的肿瘤突变负荷测量新参考物质的开发
发表期刊：Cancer Genetics
作者单位：中国医学科学院老年医学研究所国家临床检验中心等
发表年份：2022
文章地址：https://doi.org/10.3389/fonc.2022.845636

图1 文献介绍

作为影响免疫检查点抑制剂治疗决策的生物标志物，肿瘤突变负荷（TMB）估计的准确性、可靠性和可比性至关重要。该研究中，研究者开发了一组具有不同TMB值的福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE）样品作为TMB估计的新参考材料。通过使用CRISPR/Cas9技术将几种临床相关变异引入人类细胞系，构建了几种典型的细胞系并进行了外显子测序验证。然后进行细胞混合和石蜡包埋，制备了新型FFPE样品。

测序流程

图2 CRISPR/Cas9系统生成与MSH2和POLAR变体共存的新细胞系

Figure 1Generation of novel cell lines co-existing withMSH2andPOLEvariants by CRISPR/Cas9 system.(A)Schematic of the two-stage strategy for generating novel cell lines co-existing withMSH2andPOLEvariant. The sequence of sgRNAs forMSH2C199R (sgRNA-MC) andMSH2P349R (sgRNA-MP) are marked in yellow and sequence of sgRNAs forPOLEP286R (sgRNA-PP) andPOLEV411L (sgRNA-PV) are marked in blue.(B)Sequences of the PCR products showing the correct mutations of positive clones. 4 differentMSH2mut/POLEwtcell lines and 6 differentMSH2mut/POLEmutcell lines were ultimately constructed.

该研究首先使用CRISPR/Cas9系统生成与MSH2和POLAR变体共存的新细胞系，然后利用WES测序对构建的编辑细胞突变和TMB进行了检测和验证；最后，基于WES测序结果将编辑细胞进行梯度比例混合，之后制备成FFPE样本，并对FFPE样本进行WES测序，验证了FFPE样本的TMB特征和样本的均质性。结果说明FFPE参考物质具有很好的可行性、均质性和稳定性。

图3 Sentieon的作用

在该研究中，Sentieon被用于质控后续分析，包括参考序列比对、排序、局部重比对、去重复及BQSR等分析。

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