FDX1参与了铜相关的细胞死亡方式——铜死亡，这可能会影响肿瘤进展，如铁死亡和焦亡。然而，FDX1在肿瘤中的作用仍需探索。本研究从泛癌症的角度，基于综合生物信息学，调查了FDX1的表达特征以及与预后、肿瘤分期、免疫微环境和铜死亡的相关性。
1. FDX1模式的表达及其在泛癌症中的临床特征
首先，为了研究FDX1在肿瘤和正常组织中的差异表达，作者从TCGA数据库获取了FDX1的mRNA表达数据。差异表达分析结果显示，在胶质母细胞瘤（GBM）、脑低级别胶质瘤（LGG）和胃腺癌（STAD）中，FDX1在肿瘤组织中的表达水平高于正常组织（图1A）。而在乳腺浸润性癌（BRCA）、胆管癌（CHOL）、结肠腺癌（COAD）、肾嗜铬细胞瘤（KICH）、肾透明细胞癌（KIRC）、肾乳头状细胞癌（KIRP）、肺腺癌（LUAD）、肺鳞状细胞癌（LUSC）、前列腺腺癌（PRAD）、直肠腺癌（READ）和甲状腺癌（THCA）中，肿瘤组织中FDX1的表达水平降低（图1A）。接下来，作者根据GTEx数据集分析了FDX1在正常组织中的表达情况。结果显示，肾上腺、肝脏和甲状腺中FDX1的表达水平较高，而血液、大脑和胰腺中的表达水平较低。然后，肿瘤细胞系中FDX1表达的结果显示，根据CCLE数据库，它在肠道、胃、造血和淋巴组织中表达最高，在胸膜和上呼吸道中表达最低。
图1 根据癌症基因组图谱（TCGA）和基因型组织表达（GTEx）数据库，FDX1在人类泛癌中的差异表达情况
由于TCGA数据库中正常样本数量较少，作者进一步整合了TCGA和GTEx数据库来评估FDX1的差异表达。如图1B所示，FDX1在膀胱尿路上皮癌（BLCA）、乳腺癌（BRCA）、宫颈鳞状细胞癌和子宫内膜腺癌（CESC）、结直肠腺癌（COAD）、食管癌（ESCA）、胶质母细胞瘤（GBM）、肾上腺皮质肿瘤（KICH）、急性髓系白血病（LAML）、低级别胶质瘤（LGG）、肝细胞癌（LIHC）、肺腺癌（LUAD）、卵巢浆液性囊腺癌（OV）、胰腺腺癌（PAAD）、前列腺癌（PRAD）、皮肤切除性黑素瘤（SKCM）、胃腺癌（STAD）、睾丸生殖细胞肿瘤（TGCT）、甲状腺癌（THCA）和子宫肉瘤（UCS）中上调，在胆管细胞癌（CHOL）、肾透明细胞癌（KIRC）、肾盂细胞癌（KIRP）、肺鳞状细胞癌（LUSC）和直肠癌（READ）中下调。在肾上腺皮质癌（ACC）、头颈部鳞状细胞癌（HNSC）和子宫体内膜癌（UCEC）中，FDX1的表达没有差异（图1B）。
此外，作者根据GEPIA2.0在不同癌症阶段探索了FDX1的表达情况。结果显示，FDX1在甲状腺癌（F值=11，Pr(>F)=5.15e-07）、肝细胞癌（F值=6.11，Pr(>F)=0.000467）、肾透明细胞癌（F值=5.7，Pr(>F)=0.000759）、胰腺导管腺癌（F值=4.96，p=0.00253）、直肠癌（F值=4，Pr(>F)=0.0105）、肾盂癌（F值=3.34，Pr(>F)=0.0199）、食管鳞状细胞癌（F值=3.26，Pr(>F)=0.023）和肾上腺皮质癌（F值=2.81，Pr(>F)=0.0469）中表达差异显著（图2）。其他肿瘤阶段，如肾上腺皮质癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌等，FDX1的表达没有差异。
图2 FDX1表达与肿瘤分期之间的相关性
采用单变量Cox比例风险模型来探索FDX1的生存预测价值。通过OS、DSS和PFI评估FDX1的预后价值。OS结果显示，在胶质瘤（GBMLGG）中，FDX1的表达是一个风险因素（HR = 4.17，p = 1.7e-19），在低级胶质瘤（LGG）中也是一个风险因素（HR = 2.92，p = 9.5e-6），而在肾透明细胞癌（KIRC）和全肾癌队列（KIPAN）中是一个保护因素（HR = 0.48，p = 1.3e-8；HR = 0.59，p = 8.1e-8）（图3A）。DSS结果表明，在GBMLGG（HR = 4.64，p = 2.0e-20）、LGG（HR = 2.97，p = 1.5e-5）、黑色素瘤（SKCM）（HR = 1.72，p = 0.04）、KIRC（HR = 0.38，p = 6.1e-10）、KIPAN（HR = 0.50，p = 7.6e-9）、KIRP（HR = 0.56，p = 0.03）和胸腺瘤（THYM）（HR = 0.33，p = 0.03）中，FDX1与DSS相关。PFI的分析结果也表明，在肾上腺皮质癌（ACC）中，FDX1也是一个风险因素（HR = 1.34，p = 4.2e-3），而在甲状腺癌（THCA）（HR = 0.46，p = 1.6e-3）和间皮瘤（MESO）（HR = 0.54，p = 0.03）中是一个保护因素。然后，Kaplan-Meier曲线显示，FDX1的高表达与GBMLGG（HR = 3.45，p = 4.4e-18）和LGG（HR = 2.48，p = 8.1e-7）的不良预后相关，与KIPAN（HR = 0.4，p = 1.67e-7）和KIRC（HR = 0.45，p = 1.1e-7)（图3B-E）。同时，作者分析了FDX1的表达与GBM、KICH和KIRP的预后之间的关系。结果显示，FDX1的高表达与GBM（HR = 1.4，p = 0.11）和KICH（HR = 3.53，p = 0.05）的不良预后相关，与KIRP（HR = 0.54，p = 0.04）的良好预后相关。总之，这些结果明显反映了FDX1的高表达是LGG的重要风险因素，同时也是KIRC的保护因素，影响了GBMLGG和KIPAN的预后。
图3 根据TCGA泛癌症数据库，对FDX1在不同癌症类型中的总体生存（OS）进行分析
2. FDX1表达与泛癌免疫特征之间的相关性
为了探索铜死亡是否与肿瘤免疫微环境有关，作者研究了铜死亡核心蛋白FDX1与免疫的相关性。首先，作者使用TIMER算法（Li等，2017）探索了FDX1与免疫细胞浸润之间的相关性。在多种癌症中，特别是在LGG中，FDX1表达与B细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞（DC）浸润呈正相关（图4A）。除了CD4 T细胞外，FDX1还与PRAD、KIRC中的其他免疫细胞呈正相关（图4A）。另外，在STAD中，FDX1表达与CD4 T细胞、CD8 T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞呈负相关（图4A）。基于ESTIMATE分析，进一步研究了FDX1表达与肿瘤环境之间的相关性（Yoshihara等，2013）。在LGG和GBMLGG中观察到FDX1表达与StromalScore、ImmuneScore和ESTIMATEScore之间强烈的正相关（图4B-D），而在KIRC和KIPAN中观察到负相关（图4B-D）。然而，在GBM中没有显著的相关性。
图4 FDX1与泛癌症中免疫细胞浸润、LGGGBM、LGG、KIPAN和KIRC中的基质得分、免疫得分和ESTIMATEScore之间存在相关性
免疫检查点、肿瘤干细胞性质、同源重组缺陷（HRD）、TMB、MSI、DNMT和MMR是免疫治疗和辅助治疗的重要评估标志，可以预测治疗效果和患者的预后（Chiappinelli等，2016年；Luchini等，2019年；Clara等，2020年；Morand等，2021年）。因此，作者确定了FDX1表达与这些标志之间的相关性。在LGG、TGCT和UVM中，FDX1表达与大多数免疫检查点呈正相关，而在THCA和THYM中与大多数免疫检查点呈负相关（图5A）。具体而言，在LGG中，CD276（B7-H3）、CD274（PD-L1）、PDCD1LG2（PD-L2）、CTLA4、HAVCR2和PDCD1（PD-1）与FDX1强相关（图5A）。此外，肿瘤干细胞性质相关分析表明，FDX1表达与多种肿瘤类型的干细胞性质评分相关（图5B）。值得注意的是，在GBMLGG和LGG中观察到强正相关，而在GBM中没有观察到显著相关（图5B）。HRD相关分析显示，FDX1表达与14种肿瘤类型的HRD显著相关（图5C）。类似地，在GBMLGG（p = 0.00005，R = 0.16）和LGG（P = p = 2.30e-7，R = 0.23）中观察到了强烈的正相关性，而在GBM中没有观察到显著的相关性（图5C）。同时，在KIPAN（p = 7.85e-7，R = -0.19）和KIRC（p = 0.0005，R = -0.16）中观察到了强烈的负相关性（图5C）。
图5 FDX1表达与免疫检查点、DNA甲基化数据得出的干细胞程度评分以及同源重组缺陷（HRD）之间的关系
此外，作者的结果显示，FDX1与TMB、MSI、DNMT和MMR在多种肿瘤类型中密切相关。在TMB的分析过程中，结果显示FDX1与ESCA、HNSC、LGG、LUSC、STAD和UCEC中的TMB呈正相关，与KIRC、LUAD、THYM和THCA中的TMB呈负相关（图6A）。在DLBC、HNSC、KIRC、STAD和UCEC中观察到FDX1表达与MSI呈正相关（图6B）。而在LUAD、LUSC、PAAD和SKCM中，FDX1与MSI呈显著负相关（图6B）。作者研究了基于MLH1、MSH2、MSH6、PMS2和EpCAM等五个基因的FDX1表达与MMR的关联。结果显示，FDX1表达与ACC、BLCA、CESC、COAD、HNSC、KICH、KIRC、KIRP、LGG、LUSC、OV、PRAD、READ、THCA、UCEC和UVM中的MMR密切相关（图6C）。作者还研究了FDX1与DNA甲基化的关系，后者对于表观遗传学至关重要。作者分析了FDX1与包括DNMT1、DNMT2、DNMT3A和DNMT3B在内的四种甲基转移酶的关系。结果表明，在THYM、UCEC、UVM和LGG中，FDX1与DNMT1、DNMT2、DNMT3A和DNMT3B呈正相关（图6D）。除了DNMT2之外，FDX1与GBM中的其他甲基化转移酶呈负相关（图6D）。
图6 FDX1与肿瘤突变负荷（TMB）、微卫星不稳定性（MSI）、错配修复（MMR）和DNA甲基转移酶（DNMT）之间的相关性
3. 验证FDX1表达及其与脑低级别胶质瘤相关的肿瘤特征
根据以上结果，作者发现FDX1表达与预后、免疫浸润以及免疫治疗相关因素（包括免疫检查点、肿瘤干细胞性质、HRD、TMB、MMR和DNMT）在低级胶质瘤中具有显著相关性。因此，作者进一步根据中国低级胶质瘤基因组图谱数据库（CGGA）验证了FDX1在低级胶质瘤中的促肿瘤作用。针对临床特征，作者发现WHO II级、WHO III级和WHO IV级（p = 0.001）中FDX1表达存在显著差异，且FDX1在WHO IV级（GBM）中高表达，相比于WHO II级、III级（LGG）（图7A），与TCGA-GBM和TCGA-LGG的结果一致（图1A、B）。异染色酸脱氢酶（IDH）突变状态和1p/19q共缺失状态是评估胶质瘤诊断、预后和治疗情况的重要因素。作者发现FDX1在IDH野生型患者中高表达（p = 0.0052），在1p/19q非共缺失患者中高表达（p = 3.6e-09）（图7B、C）。随后，作者还说明了FDX1在不同的胶质瘤分子亚型中表达差异，包括LGG IDH突变-1p/19q编码型、LGG IDH突变-1p/19q非编码型、LGG IDH突变-野生型和GBM IDH突变、IDH野生型（p = 4.6e-05）（图7D），表明FDX1在胶质瘤分子亚型中表达差异，并提示FDX1在胶质瘤的预后和治疗中可能具有潜在功能。
图7 根据中国脑低级别胶质瘤基因组图谱数据库（CGGA），FDX1在脑低级别胶质瘤（LGG）中的差异表达情况
然后，生存分析显示FDX1的高表达是原发性胶质瘤（WHO分级）和复发性胶质瘤（WHO分级）的不良预后因素（p < 0.0001和p = 0.034）（图8A）。在不同分级中，作者的结果表明FDX1的高表达是WHO II级原发性胶质瘤（低级胶质瘤）的风险因素（p = 0.018）（图8B），这个结果与TCGA-LGG的结果相似（图3C）。然而，在WHO III级（低级胶质瘤）（p = 0.28）、WHO IV级原发性胶质瘤（高级胶质瘤）（p = 0.51）、WHO II级（低级胶质瘤）（p = 0.33）、WHO III级（低级胶质瘤）（p = 0.16）和WHO IV级（高级胶质瘤）复发性胶质瘤（p = 0.18）中，这个结果并未得到证实（图8B-D）。这些结果验证了TCGA中的生存分析结果。
图8 基于CGGA数据库的FDX1表达在胶质瘤中的总生存(OS)分析
为了阐明FDX1对LGG存活的具体机制，GSEA分析根据TCGA-LGG和CGGA-LGG（WHO II、III级）中的高低亚组，提出了FDX1的关键生物功能。生物过程结果表明，高FDX1表达亚组主要涉及免疫介导途径，包括正调节髓样白细胞介导的免疫、巨噬细胞趋化、内源性抗原的抗原处理和呈递，以及炎症反应，例如正调节Toll样受体信号通路和基于TCGA-LGG和CGGA-LGG数据集的细胞死亡调节（图9A、B）。同时，KEGG途径显示高FDX1表达亚组参与了免疫介导途径，包括白细胞经内皮迁移和B细胞受体，与炎症相关的途径，包括Nod样受体信号通路和趋化因子信号通路，以及与代谢相关的途径，如花生四烯酸代谢（图9C、D）。随后，对Hallmark途径的分析有助于研究与肿瘤相关的途径。作者的研究结果表明，FDX1基因组的高表达主要与活性氧（ROS）途径、TGF-β信号通路和蛋白质分泌有关。根据TCGA-LGG和CGGA-LGG数据库的数据（图9E，F），低FDX表达与KRAS信号通路有关。值得注意的是，这些结果反映了FDX1的生物功能涉及免疫介导的途径、炎症、代谢和细胞死亡相关的途径。
图9 FDX1基因的生物功能在TCGA和CGGA数据集中显示在LGG的生物过程（BP）途径、KEGG途径和Hallmark途径中
作者进一步验证了CGGA数据集中FDX1表达与免疫浸润之间的相关性。结果表明，在CGGA-LGG数据库中，FDX1与ESTIMATEScore（R = 0.39，p = 4.9e-8）、ImmuneScore（R = 0.39，p = 6.2e-8）和StromalScore（R = 0.37，p = 2.3e-7）呈正相关（图10A），与TCGA-LGG的结果一致（图4B-D）。在CGGA-GBM数据库中，FDX1与ESTIMATEScore（R = 0.16，p = 0.06）、ImmuneScore（R = 0.15，p = 0.07）和StromalScore（R = 0.16，p = 0.06）之间没有差异（图10B），与TCGA-GBM的结果一致。然后，相关分析显示，在TCGA-LGG（图10C）和CGGA-LGG数据集（图10D）中，FDX1表达与DC、中性粒细胞、巨噬细胞、CD4 T细胞和B细胞呈正相关。此外，在CGGA-LGG数据集中，FDX1表达与许多免疫检查点呈正相关，其中CD274、CD276、HAVCR2、ICOS和PDCD1LG2与FDX1表达在TCGA-LGG和CGGA-LGG数据集中均呈正相关。
图10 基于TCGA和CGGA数据库以及CGGA数据库中的StromalScore、ImmuneScore和ESTIMATEScore，FDX1与LGG中的免疫细胞浸润相关
4. FDX1与其他与铜死亡相关基因之间的相关性
作者采用相关性分析来阐明FDX1与铜死亡相关基因之间的关系。作者的结果表明，在TCGA-LGG数据集中，FDX1表达与铜死亡抑制基因ATP7B呈负相关，与铜死亡促进基因SLC31A1呈正相关，与铜死亡必需基因二硫辅酶S-乙酰转移酶(DLAT)、二硫辅酶脱氢酶(DLD)、硫辅酶合酶(LIAS)、脂肪酰转移酶1(LIPT1)呈正相关（图11A）。在CGGA-LGG数据集中，作者观察到FDX1表达与SLC31A1、DLAT、DLD和LIPT1之间存在类似的正相关关系（图11B）。但是，FDX1表达与ATP7B和LIAS之间没有差异。
图11 FDX1表达与铜死亡相关基因之间的相关性
总结
在作者的研究中，作者探讨了FDX1在TCGA人类泛癌中的作用，包括临床和免疫学特征。特别地，作者发现FDX1是一个预后不良的预测因子，并与CGGA的免疫微环境相关。FDX1与免疫治疗预测的标志物，包括免疫检查点、肿瘤干细胞、HRD和TMB，有密切关联，这表明它可能作为免疫治疗预测因子的潜在作用。总的来说，作者的研究应用了泛癌生物信息学分析，并发现FDX1可能被视为LGG中潜在的预后不良生物标志物和免疫治疗预测因子。但以上所有结果仍需要进一步的实验验证。
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