· 爱基百客云平台小工具使用
1.1 爱基百客云平台之GSEA分析
1.2 GSEA富集分析原理图
1.3 GSEA富集分析过程
1.4 参数设置
1.5 任务查看
1.6 结果
1.6.1 富集结果表格
1.6.2 富集可视化图解读
01
爱基百客云平台小工具使用
首先，打开爱基百客官网：http://www.igenebook.com；点击菜单栏最右侧“云平台”按钮。
弹出云平台界面（下图），输入账号、密码和验证码方可登录；进入云平台，可以轻松实现多种组学数据的分析和可视化，实现真正的“零代码、无门槛、操作简单”！
登陆后，如下图，我们进入到小工具专栏。当前云平台已上线了32款小工具供大家使用，包括基础绘图，高级绘图，差异检验，聚类分析，序列处理等子模块，本着用户至上的理念，平台小工具将会持续更新维护，积极接受用户的反馈和意见。
1.1
爱基百客云平台之GSEA分析
上期我们讲到了富集分析。那本期我们就接着来聊一聊富集分析里面的新星：GSEA（Gene Set Enrichment Analysis）富集分析。
常规的富集分析，通过log2fc筛选差异基因，将筛选差异基因的标准聚集在单个基因的差异表达上，可能会错过真正具有生物学含义的基因群差异。于是我们可以选择进行GSEA富集分析。GSEA集富集分析有以下几个优点：
1. 全局视角：GSEA不仅关注单一基因的差异，而是关注一组基因集合的整体行为，这使得它能揭示生物学过程的整体模式，而不仅仅是局部变化。
2. 生物意义：通过预定义的基因集，GSEA提供了生物学意义的验证，比如特定通路的活动，这有助于理解基因表达变化背后的生物学背景。
3. 适应复杂数据：GSEA可以处理复杂的数据分布，如连续的基因表达数据，而不仅仅是二元的上调或下调状态。
1.2
GSEA富集分析原理图
1.3
GSEA富集分析过程
1. 计算富集分数（ES） 富集分数：S 反应基因集（比如某个通路内的基因集）成员 s 在排序基因集 L（比如根据 logFC 排序的差异基因集，默认降序，所以上调基因在顶端）的两端富集的程度。富集得分 ES 最后定义为最大的peak值。正值ES表示基因集 S 在基因集 L 的顶部富集，负值ES表示基因集 S 在基因集 L 的底部富集。
2. 估计富集分数的显著性水平：因为每个基因集的大小不同，而 ES 又和基因集大小有关，因此需要对其进行 normalization。为了检验每个基因集的 NES 是否显著，将总基因集 L 随机打乱排列一定次数，每次都计算每个基因集的 NES(ES)，得到每个基因集的 NES 在随机排序情况下的理论分布，从而计算其 p 值。
3. 矫正多重假设检验 FDR 则是对 p 值进行 BH 校正之后的 p 值。
爱基百客云平台提供了GSEA分析小工具：http://124.71.149.47:5000/smalltools/detail?id=1638074560383299585。如果您在我司做过项目，直接输入差异分析表格和基因组名称即可一键式完成富集分析。
下面我们进行GSEA富集分析实操练习。
首先点击小工具GSEA富集分析。
右侧的工具介绍和常见问题对富集分析小工具的主要用途，使用方法以及结果解读做了详细的说明。左侧是必要的输入文件和参数选项。任务名称和任务编号系统会自动生成。后面可用于记录查看具体的任务。小工具提供了示例文件给用户做测试分析。同时，该页面还提供了一些常用参数调节选项。您也可进行自定义，后面将详细介绍。输出名自定义，默认Enrich。
1.4
参数设置
输入文件：支持txt(制表符分隔)文本文件，以及Excel专用的xlsx格式，同样支持旧版Excel的xls(Excel 97-2003 )格式。
差异基因表格必须包含Gene列和logFC列。如下表所示：
如果文件已经上传过，您可以直接点击选择按钮找到需要的文件勾选确定，无须再次上传。
物种选择项目中所使用的基因组名称；富集类型支持GO和KEGG；基因列和logFC列的名字根据输入表格的信息填写；显著性阈值您可根据实际情况进行筛选，默认是p.adjust < 0.05；绘图个数默认选取排名靠前的10个通路绘制，你可自行选择需要展示前多少个；输出名自定义即可。
填写好上述所有的参数后，点击提交即可。
1.5
任务查看
您可在任务管理栏中查看任务的运行情况和结果。默认情况下新任务将会在最上方展示。也可通过任务名、任务编码、日期点击查询，找到需要的任务。如下图：当状态成功时，表示任务成功结束。
点击下载按钮可直接打包下载全部结果。点击查看按钮可在线查看结果。
您可在在线查看结果后选择是否下载保存。另外如果结果较多时，结果展示区还可通过点击左侧或右侧的箭头进行图片切换。您可挑选自己感兴趣的结果图片进行下载保存。
1.6
结果
输出结果包含GSEA富集总表和若干通路的GSEA富集图。
1.6.1
富集结果表格
-
ID：通路名
-
Description：通路描述信息
-
setSize：该通路中包含表达数据集文中的基因数目（经过条件筛选后的值）
-
enrichmentScore：富集分数
-
NES：标准化后的富集分数
-
pvalue：是对 ES 的统计学分析，用来表征富集结果的可信度
-
p.adjust：是多重假设检验校正之后的 p-value
-
qvalues：是多重假设检验（FDR法）校正之后的 p-value，即对NES可能存在的假阳性结果的概率估计。GSEA 对显著性的定义为 p-value<5%，FDR q-val<25%
-
rank：当 ES 最大时，对应基因所在排序好的基因列表中所处的位置
-
leading_edge：tags 表示核心基因占该通路基因集的百分比；list 表示核心基因占所有基因的百分比；signal，将前 2 项统计值结合在一起计算出的富集信号强度
-
core_enrichment：核心富集基因集
1.6.2
富集可视化图解读
富集图一共分为上中下 3 部分。如A_VS_B差异分析：
-
第一部分 ES 折线图：显示了当分析沿着排序基因集按排序计算时，ES 值在计算到每个位置时的展示。最高峰处的ES得分 (垂直距离 0.0 最远)便是基因集的 ES 值。
-
第二部分 hits 图，俗称条形码图，用线条或者 hit 标记了通路基因集（基因组所有）中成员出现在基因排序列表中的位置。如果基因集里的基因 集中在所有基因的前部分，就是在A组里面富集，如果集中在后面部分，就是在B组里面富集。leading edge subset 就是（0,0）到绿色曲线峰值 ES 出现对应的这部分基因（x轴0到虚线那部分）。所谓 Leading-edge subset，就是对富集得分贡献最大的基因成员。如果ES得分都是正值（如上图所示），那么Leading-edge subset就在峰值ES的左侧，反之则在右侧（底部富集 = A/B 下调表达 = B 组高表达）。那么根据本图我们很容易看出，该通路在 A 组高表达。
-
第三部分是排序后所有基因 rank 值的分布，热图红色部分对应的基因在 A 组高表达，蓝色部分对应的基因在 B 组高表达，每个基因对应的信噪比（Signal2noise，前面选择的排序值计算方式）以灰色面积图展示。
如果常规富集没有拿到预期的结果，大家完全可以拿GSEA再分析一次，说不定有惊喜哦。
