每次要将手/样品伸进细胞培养箱,生物培养平台D 中时,都要喷洒酒精消毒。
以两个样品/两个培养基为例
- 从细胞培养箱(37度,5%CO2浓度)取出要染色的细胞;放在显微镜下观察,观察细胞是否趴壁以及细胞密度是否符合要求;将装有细胞的培养皿放在
D生物培养台上; - 活染步骤;从-20度冰箱中取出需要用的
染色剂A,B;将A,B放在C上振荡(但振荡会导致染色剂贴壁,而我们并不希望其贴壁);再将A,B放在微型离心机中旋转使其解冻并不贴壁(振动中的不贴壁);观察管中染色剂直至完全融化;将染色剂A,B放在D上; - 准备好废液缸,从4摄氏度冰箱取出PBS溶液(什么成分);使用1000uL移液枪将培养皿中细胞培养基转移到废液缸中(如果碰到难以吸取的部分,则倾斜培养皿,先吸外圈的液体,再从内圈边缘吸取剩余液体;如果转移途中由于摇晃过于厉害出现细胞培养基挂壁现象,由于培养基过于粘稠,则用纸巾擦拭基壁);吸取1000uLPBS溶液,从培养基外圈注入,完全注入后轻微摇晃培养基至液体完全覆盖内圈;静置5分钟(
并没有静置,不知道为什么);用PBS重复清洗(这一步骤叫清洗吗?)三次;注意事项:移液枪枪管不要碰到平台;移液枪枪管每次步骤都要更换,不要污染PBS; - 配置染色剂;取15mL灭菌离心管,从4摄氏度冰箱取出细胞培养基(什么成分)放入D中;取2000uL细胞培养基到15mL离心管中;(按1:1000配比来染色)取2uL A到15mL离心管中,并在离心管中进行吹打(吹打指:将移液枪中溶液注入再吸上,再注入再吸上,进行若干次至溶液完全融合,需要时刻注意避免过程中产生气泡);取2uL B到离心管中,吹打;注意事项:实际情况中为了避免染色剂不够用,我们想使用2000uL染色剂,实际会配置2500uL染色剂;
- 取1000uL培养基到其一培养皿中,再取1000uL培养基到另一培养皿中;将两个培养皿放到细胞培养箱中,放置30min(由于细胞还活着所以要放到合适温度,二氧化碳浓度中;箱中无光所以不需要避光);
- 死染步骤;从4摄氏度冰箱中取出细胞固定剂(
叫什么来着,甲醛?);由于细胞固定剂比较脏,我们在D中进行操作,取出5000uL细胞固定剂到15mL离心管中;将离心管进行离心(注意对称离心;离心的目的是将离心管中脏的部分到底部,而让上清液尽量干净);将离心管小心取出,平稳地转移到D中;取出2500uL上清液到另一干净离心管中 ,将脏的细胞固定液倒掉管子扔掉;将染色剂E,F取出,解冻; - 30分钟后将细胞培养基取出,在显微镜下观察(不懂显微镜使用),观察荧光染色情况;
- (
这一步不太记得了)将培养基放入D中,将细胞培养基吸出;各注入1000uL细胞固定剂;使用锡箔纸遮光,放置30min;将细胞固定剂吸出,使用PBS清洗4次;使用2000uL+2uLE+2uLF配成染色剂,过程中注意吹打;各注入1000uL染色剂,遮光放置30min;将染色剂吸出,各注入1000uLPBS,用锡箔纸包住,去楼下用STED显微镜观察;