使用PARP抑制剂Olaparib对骨肉瘤细胞进行放射增敏【AbMole】

骨肉瘤细胞来源于对辐射不敏感的骨形成间充质细胞。因此，科学家们希望找到新的方法能够使其对放射增敏。研究人员进行了使用PARP抑制剂Olaparib来增强骨肉瘤细胞的放射敏感性的研究。

研究方法主要包含以下几项实验：通过CCK-8和克隆形成实验评估Olaparib对骨肉瘤细胞增殖的影响。使用流式细胞术分析细胞周期和凋亡。使用免疫荧光染色观察γ-H2AX、53BP1和Rad51蛋白的核聚焦。评估Olaparib与辐射结合对骨肉瘤细胞双链DNA断裂的影响。

研究中用到的最重要的试剂 Olaparib 购自 AbMole生物 www.abmole.cn

AZD2281 (Olaparib) | 763113-22-0 | 美国AbMole | Olaparib; KU-0059436

具体的实验方法如下：

细胞培养：使用的细胞系包括人类骨肉瘤细胞系U2OS和鼠类骨肉瘤细胞系K7M2。
细胞在DMEM培养基中培养，添加10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素。
细胞在37°C、5% CO2的恒温培养箱中培养。

辐射条件：X射线辐射使用X-RAD225 OptiMAX辐射器进行。

外显子基因测序：对U2OS和K7M2细胞系进行外显子测序，分析DNA修复基因序列的突变。

PARPi处理：使用Olaparib粉末（M1664; AbMole, USA）溶解在DMSO中，然后用DMEM稀释到所需浓度。

CCK-8实验：使用CCK-8试剂盒测定细胞增殖。
在96孔板中添加细胞，隔夜培养后，加入CCK-8，孵育2小时后测量吸光度（OD）值。

克隆形成实验：将细胞种植在六孔板和60毫米培养皿中，经过X射线和碳离子辐射后，培养10-14天，固定和染色，然后在显微镜下观察和计数克隆。

细胞迁移实验：使用划痕实验来描述骨肉瘤细胞的迁移行为。

细胞凋亡实验：使用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测早期和晚期凋亡。

细胞周期实验：使用流式细胞术分析细胞周期分布。

免疫荧光染色：使用免疫荧光染色技术观察γ-H2AX、53BP1和Rad51蛋白的核聚焦。

Western blot分析：提取蛋白质，进行SDS-PAGE电泳，转膜，阻断，孵育一抗和二抗，使用化学发光成像系统可视化条带。

Olaparib与辐射结合显著降低了骨肉瘤细胞的增殖和克隆形成能力。Olaparib单药治疗对骨肉瘤细胞的凋亡效果有限，但与辐射结合后显著增加了凋亡细胞的百分比和G2/M期阻滞。

Olaparib增强了X射线和碳离子辐射诱导的骨肉瘤细胞凋亡。免疫荧光实验显示，与单独辐射组相比，联合组中γ-H2AX和53BP1的聚焦形成显著增加，而Rad51的聚焦数量显著减少。Western blot结果显示，Olaparib与辐射结合后，γ-H2AX和53BP1的蛋白表达水平显著增加，而Rad51的蛋白表达水平显著降低。