根据VCF设计Marker序列
问题描述：如果有两个样品的测序数据，并通过GATK等上游分析得到了变异位点信息，现在我想要找任意两个样品的差异SNP，并提取该位置上下游50bp序列，用于设计引物，应该怎么做？
本文将分享一种基于R语言从VCF文件快速获得引物设计序列的方法，用于从变异位点的vcf文件中寻找两样品的差异位点，并寻找参考基因组指定位置上下游区间，设计Marker引物序列。
1. 加载软件包
library(vcfR)
library(tidyverse)
首先加载vcfR和tidyverse包，分别用于vcf文件的读取和数据操作。
2. 设置参数
file_name <- "xxx.vcf" #输入文件名
out_name <- str_replace(file_name,".vcf","_marker.csv") #设置输出文件名
ref <- "xxx_assembly.fa" # 参考基因组序列位置
dir_samtools <- "~/miniconda3/envs/work/bin/samtools" # samtools安装位置
以上代码定义了输入和输出文件，以及samtools的位置，用于后续与参考基因组的交互检索。其中xxx.vcf文件是至少包含两个样品的变异信息数据，默认比较前两个样品。
3. 读取并合并数据
vcf <- read.vcfR(file_name)
df <- cbind(as.data.frame(vcf@fix),as.data.frame(vcf@gt))
读取VCF文件并合并固定的信息和基因型信息，生成一个数据框，用于后续数据清洗。
4. 判断变异位点类型
df$type <- NA
for (i in 1:nrow(df)){
if (df[i,10] == df[i,11]){
df$type[i] <- "same"
}else{df$type[i] <- "diff"}
}
遍历每行SNP数据，通过比较特定列来判断两样品的变异位点是相同还是不同。
5. 提取不同位点和单点突变
filter <- df[which(df$type=="diff"),]
filter_snp <- filter[grep("^s",filter$ID,value = F),]
然后筛选出不同的位点，并进一步提取单点突变（SNP），通过筛选算法只提取SNP，过滤插入缺失突变。
6. 生成中间变异位点信息
filter_snp$info <- str_c("[",filter_snp$REF,
"/",filter_snp$ALT,"]")
这句代码生成了变异位点的信息，格式为“[参考基因型/替代基因型]”。
7. 获取参考序列函数
get_seq <- function(Chr,pos_a,pos_b){
cmd <- str_c(dir_samtools," faidx ",ref," ",Chr,":",pos_a,"-",pos_b)
tem <- system(cmd,intern = T)
return(paste(tem[2:length(tem)],collapse = ""))
}
该函数使用samtools来获取参考基因组的序列信息，只需要输入染色体名称，起始位置和终止位置，就可以自动返回这段区域的序列信息。
8. 迭代获取参考序列信息
for (i in 1:nrow(filter_snp)){
seq_head <- get_seq(filter_snp$CHROM[i],
as.numeric(filter_snp$POS[i]) - 100,
as.numeric(filter_snp$POS[i]) - 1)
seq_tail <- get_seq(filter_snp$CHROM[i],
as.numeric(filter_snp$POS[i]) + 1,
as.numeric(filter_snp$POS[i]) + 100)
filter_snp$out[i] <- str_c(seq_head,filter_snp$info[i],seq_tail)
}
这部分代码迭代遍历差异SNP，并使用get_seq函数获取每个SNP附近的序列，以便于设计引物。
9. 输出结果
write.csv(filter_snp,file = out_name,quote = F)
最后，差异SNP及其周围序列的信息被保存为CSV文件，下载后就可以用于直接设计引物了。
总结
上述R脚本提供了一种方法来识别两个材料序列之间的差异位点，并设计marker引物序列，可用于生物学研究，有助于解放双手，早点下班哈哈哈哈。
完整代码如下：
library(vcfR)
library(tidyverse)
# 设置运行参数
file_name <- "xxx.vcf" #输入文件名，重测序提取的数据文件
out_name <- str_replace(file_name,".vcf","_marker.csv") #设置输出文件名，csv文件
ref <- "xx_assembly.fa" # 参考基因组序列位置
dir_samtools <- "~/miniconda3/envs/work/bin/samtools" # samtools安装位置
# 读取并合并数据
vcf <- read.vcfR(file_name)
df <- cbind(as.data.frame(vcf@fix),as.data.frame(vcf@gt))
# 判断变异位点类型
df$type <- NA
for (i in 1:nrow(df)){
if (df[i,10] == df[i,11]){
df$type[i] <- "same"
}else{df$type[i] <- "diff"}
}
# 提取两份材料中不同的位点
filter <- df[which(df$type=="diff"),]
# 提取单点突变
filter_snp <- filter[grep("^s",filter$ID,value = F),]
print(str_c("结果：共找到变异位点 ",nrow(df),
"个！其中包括差异SNP ",nrow(filter_snp),"个！"))
# 生成中间变异位点信息
filter_snp$info <- str_c("[",filter_snp$REF,"/",filter_snp$ALT,"]")
# 定义一个函数，获取参考基因组序列信息
get_seq <- function(Chr,pos_a,pos_b){
cmd <- str_c(dir_samtools," faidx ",ref," ",Chr,":",pos_a,"-",pos_b)
tem <- system(cmd,intern = T)
return(paste(tem[2:length(tem)],collapse = ""))
}
# 迭代获取参考序列信息
filter_snp$out <- NA
for (i in 1:nrow(filter_snp)){
seq_head <- get_seq(filter_snp$CHROM[i],
as.numeric(as.numeric(filter_snp$POS[i]) - 100),
as.numeric(as.numeric(filter_snp$POS[i]) - 1))
seq_tail <- get_seq(filter_snp$CHROM[i],
as.numeric(filter_snp$POS[i]) + 1,
as.numeric(filter_snp$POS[i]) + 100)
filter_snp$out[i] <- str_c(seq_head,filter_snp$info[i],seq_tail)
}
write.csv(filter_snp,file = out_name,quote = F)
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