今天给同学们分享一篇实验文章“CD8+ T cells maintain killing of MHC-I-negative tumor cells through the NKG2D-NKG2DL axis”，这篇文章发表在Nat Cancer期刊上，影响因子为22.7。

结果解读：

MHC-I阴性肿瘤的免疫疗法需要CD8 T细胞

作者先前已经证明了4-1BB激动和抗程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）检查点阻断（αPD-1/4-1BB）在小鼠CT2A胶质瘤模型中的疗效。毫不奇怪，这种疗效依赖于CD8 T细胞的存在。最近，为了研究抗原特异性反应，作者将CT2A小鼠胶质瘤细胞系改造成表达酪氨酸酶相关肽2（TRP2）的CT2A-TRP2细胞系，这是一个免疫原性较弱的模型抗原。αPD-1/4-1BB联合治疗对原位植入的CT2A-TRP2肿瘤表现出类似的疗效，导致80%的长期生存（图1a）。

最初的目的是研究肿瘤抗原呈递对肿瘤微环境的影响，作者使用CRISPR技术在CT2A-TRP2细胞系中敲除（KO）编码β2m的基因，生成CT2A-TRP2-β2mKO细胞系（图1b）。流式细胞术检测结果显示，CT2A-TRP2-β2mKO细胞缺乏MHC-I表达（H2K和H2D）（图2）。通过干扰素（IFN）-γ刺激实验进一步确认了MHC-I的敲除。IFN-γ刺激导致亲本CT2A-TRP2细胞中H2K和H2D的上调，但CT2A-TRP2-β2mKO细胞中未见上调（图3）。此外，TRP2 TCR转导的CD8 T细胞（TRP2 T细胞）未能在体外杀死CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤，但能有效杀死亲本CT2A-TRP2肿瘤，从而对CT2A-TRP2-β2mKO细胞系中MHC-I的敲除进行了功能验证（图4）。

令人惊讶的是，作者发现携带颅内（i.c.）CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤的小鼠对免疫疗法仍然有反应，对αPD-1/4-1BB联合治疗表现出100%的长期生存率，对抗4-1BB单独治疗表现出90%的长期生存率（图1e）。与CT2A-TRP2肿瘤一样，未经治疗的CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤是致命的。对CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤的免疫治疗效果不仅限于颅内区域，αPD-1/4-1BB在皮下植入的MHC-I阴性胶质瘤中仍然有效（图1f）。此外，αPD-1/4-1BB对缺乏MHC-I的原位植入黑色素瘤（B16-F10-OVA-β2mKO，以下简称B16-OVA-β2mKO）仍然有效（图1g）。最终，MHC-I阴性肿瘤的免疫治疗成功既不局限于胶质瘤，也不局限于颅内区域。

被激发了兴趣，作者试图确定免疫细胞群体对MHC-I阴性肿瘤免疫疗法的疗效负责。由于已知NK细胞能够消除缺失或减少MHC的细胞，作者首先在植入CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤之前通过消耗NK细胞进行了调查（扩展数据图1b）。即使没有NK细胞，αPD-1/4-1BB仍然能够引发100%的长期生存（图1h）。因此，作者进一步探讨了免疫治疗对CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤的疗效是否仍然依赖于CD8 T细胞，即使肿瘤没有MHC-I表达。消耗CD8 T细胞（扩展数据图1c）完全取消了αPD-1/4-1BB对携带CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤的小鼠的生存益处。这一点在肿瘤植入之前（扩展数据图1d）或肿瘤植入后早期（第3天）或晚期（第7天）时间点（图1i，j）消耗CD8 T细胞都是成立的。值得注意的是，CD4 T细胞的消耗对生存率有一定但不显著的影响（扩展数据图1e，f）。

特异性抗原杀伤在MHC-I阴性肿瘤中持续存在

继续依赖CD8 T细胞引发了一个问题，即是否还以特异性抗原的方式对MHC-I阴性肿瘤进行细胞毒杀。有趣的是，作者注意到αPD-1/4-1BB治疗的MHC-I阴性CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤的小鼠体内，TRP2特异性CD8 T细胞的数量比同样接受治疗的MHC-I阳性CT2A-TRP2肿瘤的小鼠体内更多（图2a和扩展数据图2a）。为了测试抗原特异性的作用，作者将CT2A-TRP2-β2mKO或CT2A-β2mKO肿瘤（缺乏TRP2和MHC-I表达）植入缺乏CD8 T细胞（CD8KO）的小鼠的脑内。随后，小鼠接受TRP2特异性CD8 T细胞的移植（TRP2 ALT），产生一个完全特异于TRP2的T细胞组分（图2b）。TRP2 ALT与αPD-1/4-1BB联合治疗足以消除100%的CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤（图2c），但对缺乏TRP2表达的CT2A-β2mKO肿瘤则完全无效（图2d）。此外，作者将CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤植入转基因OT-1小鼠的脑内。这些小鼠中的大多数T细胞识别卵清蛋白（OVA）肽段（OVA 257–264 ，SIINFEKL）的残基257-264，但对TRP2没有反应。在这些小鼠中，αPD-1/4-1BB的组合对CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤完全无效（图2e），进一步表明即使在没有肿瘤MHC-I抗原呈递的情况下，肿瘤特异性T细胞仍然是必需的。

上面作者证明了TRP2 T细胞无法在体外杀死CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤细胞（图1d），这证实了单独的CD8 T细胞无法杀死MHC-I阴性肿瘤，即使存在相应的抗原。因此作者假设在体内观察到的细胞毒性必须由其他细胞群体协助。在体内，浸润的髓系细胞构成了脑肿瘤微环境中的大部分免疫细胞。因此，作者检查了是否添加骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）可以让TRP2 T细胞在体外杀死CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤。CT2A-TRP2或CT2A-TRP2-β2mKO（图3a）肿瘤细胞与TRP2 T细胞一起培养，同时加入TRP2肽负载的BMDMs（TRP2巨噬细胞）或未负载的BMDMs（未负载巨噬细胞）。虽然TRP2 T细胞单独（但不是TRP2巨噬细胞）能够有效杀死MHC-I阳性的CT2A-TRP2肿瘤，但是TRP2 T细胞单独或TRP2巨噬细胞单独都无法杀死MHC-I阴性的CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤。然而，令人惊讶的是，TRP2巨噬细胞和TRP2 T细胞的组合确实足以在体外杀死CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤。有趣的是，未经脉冲处理的巨噬细胞与TRP2 T细胞的组合也未能导致对肿瘤细胞的显著杀伤，这表明巨噬细胞与CD8 T细胞之间的抗原-同源相互作用对于对缺乏MHC-I的肿瘤细胞产生细胞毒性是必要的。虚假的TCR转导的CD8 T细胞无法杀死任何一种肿瘤细胞系，即使在TRP2负载的巨噬细胞存在的情况下也是如此。重要的是，作者使用OVA特异性OT-1 T细胞和OVA脉冲的巨噬细胞在另一种表达不同靶抗原（OVA）的小鼠胶质瘤细胞系（GL261）中重复了这些发现（图3b-d）。

CD8 T细胞通过直接接触杀死MHC-I阴性肿瘤

作者接下来研究了杀死缺乏MHC-I的肿瘤细胞的机制要求。首先确定是否涉及可溶性因子，作者使用了0.4微米的Transwell板，它允许细胞因子和其他可溶性介质自由通过，但不允许细胞通过。将MHC-I阴性的CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤细胞放置在Transwell板的底部，TRP2 T细胞和TRP2巨噬细胞的不同组合被添加到膜的同侧或对侧。将T细胞和/或巨噬细胞与肿瘤细胞物理分离消除了肿瘤杀伤活性，表明需要直接细胞间接触而不是可溶性因子（图4a）。

然后作者调查了巨噬细胞或T细胞是否更直接地参与了接触依赖性肿瘤细胞毒杀机制。为了进行这些实验，作者使用了5.0微米的Transwell板，这样较小的T细胞可以通过到含有肿瘤细胞的孔底部，而较大的巨噬细胞则无法通过（验证见扩展数据图3a）。CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤细胞被放置在Transwell插入物的对面，与T细胞和巨噬细胞隔开。这种设置允许T细胞首先与巨噬细胞直接接触，然后通过膜与肿瘤细胞直接接触。在这种情况下，肿瘤杀伤的程度与三种细胞类型都接触时没有显著差异（图4a）。这表明，杀伤MHC-I阴性肿瘤需要肿瘤细胞与TCR刺激的T细胞直接接触，而巨噬细胞只需要提供前驱抗原特异性T细胞刺激的角色。

NKG2D介导T细胞对MHC-I阴性肿瘤的识别

为了阐明CD8 T细胞识别MHC-I阴性肿瘤的细胞-细胞接触依赖机制的性质，作者首先采用无偏方法，研究了抗原特异性CD8 T细胞在暴露于MHC-I阴性肿瘤和相应抗原负载的巨噬细胞时的炎症基因表达谱的差异。将与OVA脉冲的巨噬细胞共培养的经过激活的OT-1 T细胞的基因集与仅与OVA阴性CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤细胞共培养的经过激活的OT-1 T细胞进行比较。使用OVA阴性的β2mKO肿瘤细胞系以确保肿瘤-TCR相互作用的缺失。这些实验中的OT-1细胞的TCR激活是通过与OVA脉冲的巨噬细胞同时培养来完成的。接触CT2A-TRP2-β2mKO细胞的TCR激活的OT-1细胞表达了标志NK和T细胞功能的基因，而仅仅是TCR激活的OT-1细胞没有这种增加（图5a）。在T细胞功能基因集中，不同表达的基因包括编码激活标志的基因，但不包括直接接触介导的细胞毒性的受体（扩展数据图4a). 值得注意的是，在凋亡基因集中，Tnfsf10的表达略有增加，该基因编码TNF相关凋亡诱导配体（TRAIL）（log 2 （折叠变化）= 0.562，调整后的P值= 0.0262）（扩展数据图 图4b）。因此，考虑到其在接触依赖性T细胞细胞毒性中的已知作用，作者调查了TRAIL是否参与杀死体外MHC-I阴性肿瘤。然而，阻断TRAIL并没有显著减少T细胞介导的体外细胞毒性，无论是针对MHC-I阳性还是MHC-I阴性肿瘤（扩展数据图 图4c）。

在NK细胞功能基因集中，Klrk1的表达在暴露于CT2A-TRP2-β2mKO细胞的OT-1细胞中特别突出（图5b，log（折叠变化）= 1.1，调整的P值= 3.25×10）。NKG2D是一个激活受体，传统上与NK细胞的细胞毒功能相关，尽管它也在活化的CD8 T细胞上表达，其作用主要被描述为共刺激。在小鼠中，NKG2D的配体是β2m非依赖的非经典MHC-I分子RAE-1、H60和MULT-1。与在所有有核细胞上表达的经典MHC-I不同，非经典MHC-I的表达通常是由应激诱导的，并且在肿瘤细胞上上调。已经显示肿瘤细胞上非经典MHC-I的表达在接受化疗或电离辐射后进一步上调。

同样地，在TCR激活后，NKG2D受体与靶细胞上的配体结合，激活NKG2D细胞中的细胞毒性效应，包括释放细胞毒性颗粒和表达Fas配体（FasL）。特别是在CD8 T细胞中，NKG2D细胞效应似乎依赖于同时的TCR激活，以将效应活性限制在适当的周围靶标上。在小鼠CD8 T细胞中，NKG2D表达在TCR激活后上调（扩展数据图4d）。由于作者模型中CD8 T细胞介导的MHC-I阴性肿瘤杀伤也依赖于TCR激活，但不需要T细胞与肿瘤细胞之间的抗原配对相互作用，作者假设NKG2D可能是肿瘤杀伤机制的重要因素。为了初步评估这一点，作者首先检查了模型中T细胞上的NKG2D表达。因此，作者检查了未经处理的小鼠中浸润CT2A-TRP2或CT2A-TRP2-β2mKO胶质瘤的CD8 T细胞上NKG2D表达的差异，以及经αPD-1/4-1BB治疗的小鼠中的差异。NKG2D水平在治疗的MHC-I阴性CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤浸润的CD8 T细胞上明显高于治疗的MHC-I阳性肿瘤或未经处理的肿瘤（图5c）。检测到T细胞上NKG2D水平的增加，作者反过来检查了两种MHC-I阴性肿瘤系的相关NKG2DLs的存在。发现CT2A-TRP2-β2mKO系高度表达非经典MHC-I分子RAE-1和MULT-1，这些发现在额外的胶质瘤系GL261-OVA-β2mKO中得到了重复（扩展数据图4e,f）。

为了研究NKG2D对CD8 T细胞对MHC-I阴性肿瘤的功能贡献，作者重复了作者之前的体外肿瘤细胞毒杀实验，这次在有或没有NKG2D阻断抗体的情况下进行。OT-1 T细胞再次与OVA阴性、MHC-I阴性的CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤细胞培养，尽管在这些实验中，作者使用CT2A-OVA细胞作为OVA抗原呈递和OT-1 TCR激活的来源。与作者之前的结果一样，只有在有OVA呈递细胞的情况下，OT-1 T细胞才能成功杀死CT2A-TRP2-β2mKO肿瘤（图5d）。然而，在存在抗NKG2D阻断抗体的情况下，对CT2A-TRP2-β2mKO细胞的杀伤完全被抑制（图5d）。使用CT2A-OVA肿瘤作为OVA TCR刺激的来源还使作者能够评估抗NKG2D治疗对MHC-I阳性肿瘤细胞的伴随杀伤的影响。在任何条件下，CT2A-OVA细胞都能够被轻易杀死（扩展数据图4g）。

NKG2D信号传导的下游细胞毒性效应物可以包括颗粒酶、穿孔素和FasL29，31，这就提出了一个问题，即在作者的系统中，其中哪些可能介导MHC-I阴性肿瘤细胞的杀伤。作者的表达分析数据显示，颗粒酶B和FasL表达增加（扩展数据图4h，i）在暴露于MHC-i阴性肿瘤的TCR激活的T细胞中，表明脱颗粒可能在抑瘤机制中发挥作用。事实上，与单独的巨噬细胞相比，在MHC-I阴性肿瘤细胞和携带同源抗原的巨噬细胞存在的情况下，OT-1 T细胞的脱颗粒增加（图5e）。鉴于先前研究的结果32-34，作者还专门测试了FasL-Fas相互作用的作用。肿瘤浸润性CD8+T细胞上FasL的表达在免疫治疗的反应中增加，但在从MHC-I阳性肿瘤和MHC-I阴性肿瘤中分离的CD8+T淋巴细胞中没有显著差异（扩展数据图4j–l）。此外，在体外，抗原阴性Fas受体KO（FasKO）黑色素瘤仍然易被TCR激活的CD8+T细胞杀死（扩展数据图图5a），表明FasL-Fas相互作用对肿瘤抑制机制并不重要。

总结

在这里，作者描述了MHC-I和抗原非依赖性CD8+T细胞杀伤肿瘤细胞的机制，该机制在体内和人类肿瘤细胞中一致可见。作者证明，CD8+T细胞依赖性免疫疗法确实可以对肿瘤保持有效，即使在完全缺乏MHC-I的情况下也是如此。需要进一步研究NKG2D和NKG2DL在介导肿瘤免疫治疗易感性中的作用，以及这些发现的其他潜在治疗意义。对这篇文章的思路感兴趣的老师，欢迎咨询！