WGCNA分析流程及内容解读

文章标题：通过 WGCNA 和机器学习识别和验证与免疫和氧化应激相关的糖尿病肾病诊

发表年限：2023年

期刊：Frontiers in Immunology

影响因子：5.7

研究背景：

糖尿病肾病（DN）以蛋白尿、高血压和肾功能进行性减退为特征，是发达国家终末期肾病最常见的病因，造成了严重的社会和经济负担。研究表明，随着全球糖尿病发病率的上升，DN患者的人数也在不断增加，预计在未来20年左右的时间里，全球糖尿病发病率将从5.37亿人上升到7.83亿人。与此相反，目前的治疗方案强调肾素-血管紧张素系统阻断、血压管理和血糖控制。因此，DN诊断和治疗迫切需要新的靶点。近年来，随着生物信息学的发展，其研究技术已被积极用于探索包括DN在内的多种疾病的靶点。

研究结果：

本文中，作者使用R软件包"WGCNA"构建了WGCNA，以识别与糖尿病肾病患者免疫细胞相关性最高的模块。具体来说，首先对样本数据进行了预处理，并剔除了异常值。随后，"WGCNA"软件包构建了相关矩阵。选择最佳软阈值将相关矩阵转换为邻接矩阵，并根据邻接矩阵创建拓扑重叠矩阵（TOM）。利用基于TOM的相异性度量，采用平均关联分层聚类将具有相似表达模式的基因归类为基因模块。与免疫细胞相关性最强的两个模块被选为关键模块，用于后续分析。

该研究中软阈值功率校准为0.85（图B）。最后，WGCNA分析显示了11个模块的总和（图C）。其中，绿色模块和品红色模块分别与T细胞CD4幼稚亚群和γ δ 亚群有很强的正相关性。由于绿色模块和品红色模块与免疫浸润细胞有重要关联，因此考虑对这两个模块进行进一步研究。

从上述文章中可以看出，WGCNA分析可用于识别高度相关的基因模块，总结模块之间的相互联系以及与外部样本性状的关联，并识别候选生物标记物或治疗靶点。

WGCNA，全称为weighted gene co-expression network analysis，即加权基因共表达网络分析。它是一种分析多个样本基因表达模式的分析方法，可将表达模式相似的基因进行聚类，并分析模块与特定性状或表型之间的关联关系，在研究表型性状与基因关联分析等方面的研究中被广泛应用。

1.数据输入、清洗和预处理

使用R包”WGCNA“进行分析，输入数据一般为fpkm表达量数据，推荐5组(或者15个样品)以上的数据，数据的行为基因，列为不同样本的基因表达量。

2.使用goodSamplesGenes检查缺失值和识别离群值（异常值）

如果gsg$allOK的结果为TRUE，证明没有缺失值，可以直接下一步。如果为FALSE，则需要用以下函数进行删除缺失值。

对所有样本进行聚类，观察是否有离群值或异常值，如果有离群值则要删去离群的样本。

3. 读入样本信息并进行筛选，得到表型数据与表达量数据二者共有的样本数据，并重新构建聚类树。

颜色越深，代表这个表型数据与这个样本的基因表达量关系越密切。将此步骤的数据进行保存，命名为file1。

4.对匹配后的样本基因表达量数据和表型数据进行分析，选择合适的软阈值构建网络，并绘制层次聚类树。

5. 选择合适的软阈值构建自动化网络和检测模块，使用sft$powerEstimate查看推荐的软阈值

6.为了更清晰地反映出样本基因的聚类关系，我们将这些基因划分成了若干个模块，每个模块至少存在30个基因，每一个颜色代表一个模块，将划分后的模块和样本基因的层次聚类树一起显示，如下图所示：

保存模块信息：file2

7.载入file1和file2，将性状信息和模块信息相关联，并绘制模块与性状之间的相关性热图。

图中红色为正相关，蓝色为负相关，颜色越深则相关性越强

8.加权网络可视化

可视化加权网络的方法之一是制作热图。热图的每行每列代表一个基因，浅色代表低邻接；深色代表高邻接，基因之间的邻接程度低意味着基因之间的度量值较小，即他们之间之间的相似性较低，这可能表示它们在表达模式、功能或调控方面存在较大的差异。相反，邻接程度高表示基因之间的度量值较大，即它们之间的相似性较高。这可能表示它们在表达模式、功能或调控方面存在相似性。由于样本的基因数量较多，我们从中随机选取了400个基因进行绘图，图片如下所示：

9.此外，可以使用分析结果针对特定模块绘制相关性网络图，还可以将数据导入到相关软件中（如：Cytoscape）进行相关性网络的可视化。

参考文献：

Xu M, Zhou H, et al. Identification and validation of immune and oxidative stress-related diagnostic markers for diabetic nephropathy by WGCNA and machine learning. Front Immunol. 2023 Feb 22;14:1084531.
Langfelder P, Horvath S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 2008 Dec 29;9:559.