1，

on and off状态

以及表达的量

2，

基因调控的生物学影响？

超过400多种细胞类型，数目上37万亿

不是所有的基因都表达

为什么多核真核细胞需要基因调控？

单个细胞往多个细胞逐渐进化的过程，形成复杂的细胞群之间的协作，需要不同的细胞类型和功能，专业的细胞做专业的事；

但他们的基因组又都是一样的，所以我们必须调控基因的on和off以及量。

3，

必须要快速扩充拷贝核糖体（细胞分裂相关）：

1个专业的区域：核仁（生物化学的亚区室）：工厂，专业的地方做专业的事

gene的拷贝多

1个前体RNA可以产生3个成熟的rRNA

有专门的RNA pol 1以及3，用的分别是RNA pol I以及III，就不会和pol II竞争了（有专业的pol）

——》使得rRNA产生是比较高效的，又可以在核仁里装配（快速高效地实现核糖体的复制生产）

弥补核糖体的不足，在分裂以及其他环境中

4，

C、A

5，

、

无膜细胞器：
类比开放以及不开放的系统：
有膜的，蛋白质进出细胞需要管控，消耗能量；

无膜就没有，但是安全性比较差，金出版比较灵活。

无膜细胞器——》联想相分离

生物分子缩合（凝聚）有2大类：
1类是IDR，和转录相关、chromatin相关的蛋白质就有更多的IDR；

另外1种是蛋白质里面的连续互作模块，通常会被修饰，比如说是PTM的磷酸化修饰，修饰之后会产生模块与模块之间的互作，蛋白质的聚集，帮助信号的放大；

6，

MLO是无膜细胞器：

如果全部都是G容易形成胶状，如果是AUC，则为液状；

调节RNA长度：转录中止，或者是可变剪接等

RNA的修饰可以识别一些特异性的reader（注意是reader，writer，eraser），可以产生RRPS，或者不产生

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1，

DNA如何编码转录输出：感觉还是从顺式调控元件或者反式互作因子来讲

2，

TF的DNA binding domain（其实就是motif对应的结构域）是怎么样的？

ZF结构可以串联：比如说CTCF可以串联11个，达到42bp识别的DNA序列左右；

3，

如何设计一个实验用于过表达Runx1 gene以及eGFP，形成一个双顺反子的表达体系

单顺反子：1个mRNA对应1个蛋白

多顺反子：1个对多个

双顺反子：1个对2个

首先：如果要表达对应的Run1 gene，肯定要将对应的CDS序列（gene编码区）clone出来；

因为要形成1个双顺反子系统，那么我们和谁进行双顺反子呢，就是eGFP。

依据前面的知识，那我们肯定在两者之间放P2A或者是T2A

为了有效的表达，就需要在多克隆位点进行插入；

首先是质粒上的CMV的promoter，然后是BGH的poly A（这些是原始的序列）

然后紧接着就是将T2A或者是P2A与我们感兴趣的基因进行融合，也就是上面所说的双顺反子的Runx1以及eGFP；（也就是上面右边所对应的基本的序列结构）

然后为了高效的表达，也就是蛋白质表达的水平高

=========》总之一切就是按照上面的解答

4，

如何测量基因组范围内强子的强度；

增强子的经典定义：增强gene转录的一段DNA片段；

假设我们是将增强子放到基因编码区的下游，正好处在3’-UTR的位置，

那RNA测序一测就知道这条RNA表达的水平高低；

如果RNA多，说明它增强子的活性高，因为它们的启动子是一样的；

这段DNA序列驱动启动子，转录的RNA就多了；

原理上应该是指不影响原先基因的功能结构的前提下在编码区域插入了一个增强子的序列，然后与原先的input的数据进行对照，也就是说区别只有增强子序列区别的有无，然后对照同一个gene转录出来的转录本的水平高低，来测量对应的增强子序列的活性。

===================》两者相互结合就是：

然后另外就是与经典报告基因的方式进行比对，

传统的方式就是报告基因的方式，但是是1个1个做的，

5，

首先是将几组DNA使用超声进行打碎，将特定的DNA片段克隆到对应的载体上，这样就可以驱动对应的基因进行编码；

这个时候放个barcode，这样在mRNA上也就有了barcode；

我们会同时测定DNA以及RNA；

然后RNA的多少就会决定promoter的活性，然后mRNA里面就有barcode

然后barcode和promote序列就有一一对应的关系

然后mRNA水平的多和少就能够决定promoter的活性。

实际上就是SuRE技术：对照图解就是

前两行是组蛋白的修饰（启动子的marker），后面两行就是对应的SuRE的实验结果；

DNA序列放到promoter位点是有方向性的，然后正反的话peomoter的活性是有区别的，当然也有一些双向性的promoter的序列，正着放以及反着放，promoter的活性都很高

同理是否能够设计一个genome wide实验来测量启动子的活性？

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1，

按照上面的图回答主要的步骤：

2，

CUT&RUN依赖于MNase（不能sc），CUT&Tag依赖于Tn5

应用场景

ChIP-seq：组蛋白百万，TF千万

3，

4，

真核细胞、

CDK1/2是调节有丝分裂比较重要的gene，前面的CRISPR不好使，如果把DNA弄没了，protein不能表达了，就会严重阻碍分裂过程，细胞就不分裂了，就凋亡了（就不能研究作用机制了，也就是所谓的敲除致死问题）。

——》所以不能使用简单的CRISPR介导的敲除技术去敲除

对于这些特殊的gene：

通过在gene下游敲入这3个标签：
2A-eGFP的报告基因

HA作为蛋白western blot的标签

优势：快、更高效

而且可逆：将植物生长激素诱导剂撤离之后，因为原本只是在蛋白质水平的一个降解，撤除之后RNA还能继续翻译，又能快速地还原回来rescue回来

5，

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1，

诺贝尔奖是从1901年开始的

2，

photo51

热情（enjoy研究）、不放弃、有点运气

合作：collaboration——》

热情和紧迫感：

毅力、坚持：

3，

新冠病毒是正链RNA病毒，不是反转录病毒

4，

反转录酶有无？

人类细胞是有反转录酶，端粒酶；

端粒就是靠端粒酶加到染色体末端上的，

端粒酶是一个自带模板的反转录酶，自带的模板是RNA，它就将那段RNA反转录接到染色体的末端

5，

上面这张图有2个明显的错误：
（1）RNA加工：主要包括3个步骤，5’加帽，中间去掉内含子，3’加polyA尾

但是RNA加工不是指1个RNA转录出来之后再去做这3件事情，RNA加工的3个步骤而是和转录同步进行的，

也就是在转录25个nt核苷酸左右，就开始加帽等

（2）PTM既可以发生在细胞质中，也可以发生在细胞核中

5，

核小体有什么意义？

（1）人类细胞直径大概在10μm，DNA首尾相接2m长

折叠压缩，保持稳定，裸露DNA容易降解——》保护我们的基因组，维持稳定性

（2）1套基因组产生至少200多种细胞：
所以我们需要实现全局转录抑制，再选择性表达（才有选择性表达的前提），才能成为多细胞生物

真核转录有什么意义？（要和原核相比，我们当然知道转录才有蛋白）

这个问题是说原核和真核转录都很重要，因为都是产生蛋白质的前提，但是相比之下真核的意义是什么？

真核的表达是选择性表达，基因表达的主要调控过程主要是4个地方：
转录、RNA加工、翻译、翻译后修饰

——》那么差异是在哪里出现的，就是转录

是差别转录，真核生物特有转录的重要意义是什么？

因为差别主要是从转录开始的，当然其他步骤都可以出现差别；

体细胞到干细胞的4个gene都是TF。

6，

原核有1种RNA pol，为什么真核需要3种？
各司其职，不竞争：产生不同的RNA，专职做，效率高——》why要专职？

——》还是要从RNA加工上去想

就是说不同的RNA有不同的加工需求，有需求，所以要专职做

因为mRNA需要前面所说的3步的加工以及调控，而原核的RNA pol没有接到过这种活

——》所以意思就是：以mRNA为例，真核生物有RNA加工的差异需求，所以有专职的需求，所以有专职的RNA pol进化出来

7，

真核转录单元比原核多了enhancer（另外exon、intron的补充）

一定要从多细胞的角度来讲，就是选择性表达（就是cell类型）

（1）核小体全局抑制，然后enhancer进行选择性调控，可以在有表达需求的特异性gene上构建增强子

（2）或者我们只考虑了启动子，都有表达——》然后问题还可以接着问：同1个gene，都表达，只是量不同，也是需要增强子调控的

所以综合起来就是回答了2方面的问题：on and off，以及量的问题

enhancer有很多功能，主要关注在不同细胞类型中实现同1 gene的差别表达水平

8，

转录激活能力特别强的enhancer

SE和TE之间的区别：

主要就是H3K27ac的ChIP-seq识别enhancer，然后对这些enhancer进行聚类clustering（将距离小于12.5kb的enhancer的peak进行聚类合并为一个enhancer）——》多个enhancer聚类在一起

转录共激活因子以及组蛋白修饰水平的区别

主转录因子：OSN等

1987 LCR（血红蛋白β亚基） vs 2013 SE

mTF：定义cell类型身份，改变细胞命运，通常需要更高水平，通常由SE调控，SE也通常由mTF结合

8，

相分离：细胞质是液态环境，核质也是液体环境，如果要形成相分离，就是从液相中分离出来（与水相分离），形成的是类似于油滴一样的状态。

油水分离

（1）提到无膜细胞器：就是一种相分离，只不过这种油相比较大

（2）另外存在一些比细胞核中的核仁等大油相还小的油相，就是蛋白质和蛋白质之间形成的接近于油状一样的液滴

或蛋白质和RNA聚集在一起，所形成的和水相的分离，近似于油和水的分离

那这个相分离和SE有什么关系

SE是聚类enhancer，高密度TF结合

相分离是需要一定浓度的，只有浓度达到一定阈值才会相分离

SE很大，有很多TF结合位点，就有很多蛋白质聚集在一起，浓度就会超过阈值，就会形成相分离；

SE调控的机制的一种way：多价相互作用的相分离

重复结构域、IDR区域促进相分离

9，

激酶的催化中心一般是个口袋

TF通常没有口袋

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1，

2，

cap-1（绝大多数）

3，

4，

同1个gene产生多个蛋白，答案见下

5，

原核：多顺反子

真核：可变剪接

真核示范gene：

平均长度27kb，平均含有8.8个外显子，9-1个内含子

外显子平均长度145bp，内含子3.3kb

DNA的1/4是内含子

6，

内含子：
选择性剪接，使得1个gene产生多种具有不同功能的蛋白（多个产物）

保护gene组功能

一些内含子区域后来被发现是非编码RNA

enhancer可以在基因间，也可以在内含子上

7，

RNA加工的过程：
poly A稳定性——》辅助mRNA的稳定性

影响mRNA翻译

polyA的长度和蛋白质水平成正相关（影响蛋白质水平）

翻译的闭环模型：

CAP-1如果没有的话，会被识别然后自免疫

8，

选择性多聚腺苷酸化，影响的是末端3’-UTR的长度，不是影响polyA

——》选择polyA位点，影响mRNA 3’端UTR的多样性

——》选择性3’端

影响蛋白质组的多样性

3’UTR末端加上去的poly-A，这个活是poly A聚合酶干的，不是RNA聚合酶干的

重要性：

细线：内含子

宽box：翻译成蛋白质
窄box：UTR，在成熟mRNA中，但是不翻译成蛋白质

9，

斯微

缺点：不稳定，不带修饰的话会激活自免疫

10，

11，

小核酸药物：

12，

长非编码RNA：

13，

利用1个gene产生多个蛋白质

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1，

2，

3，

4，

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1，

2，